【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测DNA中N
‑4‑
乙酰基脱氧胞苷的方法和试剂盒
[0001]相关申请的引用
[0002]本申请要求2019年12月23日提交的美国临时申请62/953,062的优先权日的权益,其内容通过引用以其整体并入本文。
[0003]背景
[0004]文献(ACS Chem.Biol.(2017),12,2922
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2926)中已经描述了剖析RNA中胞苷乙酰化的方法(“N4
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acrC”)。关于类似的RNA修饰的技术还包括ACS Chem.Biol.(2018),140,12667
‑
12670:A Chemical Signature for Cytidine Acetylation in RNA。
[0005]附图简述
[0006]并入本文并构成说明书一部分的附图图示了示例性实施方案,并且与描述一起进一步用于使相关领域的技术人员能够作出和使用这些实施方案以及对本领域技术人员来说将是明显的其他实施方案。将结合以下附图更具体地描述本专利技术,在附图中:
[0007]图1示出了N4
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乙酰基脱氧胞苷的化学结构。
[0008]图2示出了N4
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acdC DNA免疫沉淀测序的示例性实施方案。
[0009]图3示出了免疫沉淀测序的对照,其中使用诸如NH2OH、NaOH或AMA(NH4OH/MeNH2混合物)的碱性试剂将DNA脱乙酰化。这样的物质的免疫沉淀允许人们理解在测定中使用的N4
...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】(氢氧化铵/含水甲胺或AMA试剂)试剂。11.根据权利要求10所述的方法,其中NaOH还用作变性剂。12.根据权利要求1和7所述的方法,其中用抗N4
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acdC或抗N4
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乙酰胞苷(“4N
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AcC”)抗体来免疫沉淀所述核酸分子。13.一种方法,包括:a)提供包含核酸分子的样品;b)通过在存在亲核试剂的情况下用亚硫酸氢盐处理所述核酸分子来使所述分子中未修饰的胞苷转氨基化;c)使所述核酸分子中的N4
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acdC残基脱氨基化以产生尿嘧啶残基,(例如,用亚硫酸氢盐);和d)对脱氨基化的核酸分子进行测序,其中N4
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acdC残基将读出为胸苷;e)任选地提供对照样品,其中在使未修饰的胞苷转氨基化之前,N4
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acdC残基被脱乙酰化,其中,随后,N4
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acdC将读出为胞嘧啶。14.一种方法,包括:a)提供包含核酸分子的样品;b)通过在存在亲核试剂的情况下用亚硫酸氢盐处理所述核酸分子来使所述分子中未修饰的胞苷转氨基化;c)使5
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甲基胞嘧啶(5mC)、5
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羟甲基胞嘧啶(5hmC)和5
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甲酰基胞嘧啶(“5fC”)转化为5
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羧基胞嘧啶(“5caC”)(使用例如十
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十一易位甲基胞嘧啶双加氧酶);d)用碳二亚胺和含伯胺的亲核试剂封闭5caC残基;e)使所述核酸分子中的N4
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acdC残基脱氨基化以产生尿嘧啶残基,(例如,用亚硫酸氢盐);和f)对脱氨基化的核酸分子进行测序,其中N4
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acdC残基将读出为胸苷。15.一种方法,包括:a)提供包含核酸分子的样品;b)处理所述核酸以将胞嘧啶转化为5
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甲基胞嘧啶(“5mC”),例如用甲基化酶或甲基转移酶诸如mSssI处理;c)使5
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甲基胞嘧啶(“5mC”)、5
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羟甲基胞嘧啶(“5hmC”)和5
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甲酰基胞嘧啶(“5fC”)转化为5
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羧基胞嘧啶(“5caC”)残基,例如通过用十
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十一易位甲基胞嘧啶双加氧酶(“TET”)来处理;d)用碳二亚胺和含伯胺的亲核试剂例如苄胺封闭5caC位点;和e)使用亚硫酸氢盐将N4乙酰基脱氧胞苷(“N4
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acdC”)残基转化为尿嘧啶残基;和f)对转化的核酸分子进行测序,其中N4
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acdC残基将读出为胸苷。16.根据权利要求15所述的方法,其中胞嘧啶通过化学方式或用CpG甲基转移酶(例如来自细菌或植物)转化为5mC。17.根据权利要求15所述的方法,其中所述TET选自TET1、TET2、TET3、小鼠TET、果蝇TET(CG43444)和NgTET(纳氏虫属(Naegleria)Tet样双加氧酶)。18.一种方法,包括:(a)用限制性酶消化包含N4
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acdC残基的DNA,其中所述限制性酶不消化包含N4
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acdC的
限制性位点(例如Sac I);(b)使消化的DNA变性、脱乙酰化和脱磷酸化;(c)对变性、脱乙酰化和脱磷酸化的DNA进行第二链合成,以产生双链DNA分子;(d)用所述限制性酶消化来自操作(c)的双链DNA,留下裂解的磷酸化分子;(e)将衔接子分子附接到所述裂解的磷酸化分子以产生衔接子
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标签分子;和(f)任选地,通过PCR扩增并对所述衔接子
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标签分子进行测序。19.一种方法,包括:a)提供包含核酸分子的样品;b)用脱乙酰化剂、还原剂或通过附接加合物处理所述核酸中的N4
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乙酰基脱氧胞苷(“N4
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acdC”)残基;和c)通过纳米孔测序对经处理的核酸分子进行测序,其中经处理的N4
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acdC残基在测序期间产生电流或电压的特征性变化。20.一种用于鉴定结合到DNA中的N4
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acdC或者结合到含有N4
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acdC的DNA序列的候选蛋白的方法,所述方法包括:(a)产生DNA样品的片段;(b)使所述DNA片段的第一部分但不是第二部分与脱乙酰化剂接触;(c)使来自所述第一部分和所述第二部分的DNA与测试蛋白接触;和(d)将结合到所述第一部分中的DNA的蛋白的量与结合到所述第二部分中的DNA的蛋白的量进行比较;其中以比所述第一部分更大的量结合到所述第二部分中的DNA的蛋白是候选N4
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acdC结合蛋白。21.根据权利要求20所述的方法,其中所述蛋白通过质谱来鉴定。22.一种用于鉴定状况的生物标志物的方法,所述方法包括:(a)从具有所述状况的多于一个受试者中的每一个获得第一组DNA样品;(b)从不具有该状况的多于一个受试者中的每一个获得第二组DNA样品;(c)生成所述第一组DNA样品和所述第二组DNA样品的片段;(d)将来自所述第一组DNA样品和所述第二组DNA样品中每一个的片段分别与N4
‑
acdC结合剂接触;(e)使结合剂与所述第一组DNA样品和所述第二组DNA样品中的DNA片段之间的复合物富集;和(f)确定从所述第一组DNA样品和所述第二组DNA样品获得的复合物中的DNA片段的核苷酸序列;其中与所述第二组DNA样品相比,在用所述第一组DNA样品形成的复合物中更丰富的DNA序列是所述状况的生物标志物。23.根据权利要求20所述的方法,其中所述状况选自癌症、感染性疾病或遗传性疾病。24.根据权利要求20所述的方法,其中所述DNA样品从肿瘤、体液、组织或器官获得。25.根据权利要求24所述的方法,其中所述体液是血液、血浆、血清、唾液、痰、粘液、淋巴液、尿液、精液、脑脊液或羊水。26.根据权利要求20所述的方法,其中所述DNA样品包含无细胞DNA(cfDNA)。
27.根据权利要求20所述的方法,其中所述DNA片段通过声处理、剪切或酶促片段化获得。28.根据权利要求20所述的方法,其中所述DNA样品是染色质。29.根据权利要求20所述的方法,其中,所述DNA样品是裸露的DNA。30.根据权利要求29所述的方法,其中所述DNA样品是双链的。31.根据权利要求29所述的方法,其中所述DNA样品是单链的。32.根据权利要求31所述的方法,还包括,在步骤(a)之前或之后,使所述DNA变性。33.根据权利要求20所述的方法,其中所述N4
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acdC结合剂是(a)抗体,(b)天然存在的N4
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acdC结合蛋白,或(c)已被工程化以与N4
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acdC结合的蛋白。34.根据权利要求20所述的方法,其中所述富集通过免疫沉淀、亲和...
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