一种高原植物冰川棘豆总RNA提取的方法技术

本发明专利技术公开了一种高原植物冰川棘豆总RNA提取的方法，属于分子生物学领域。该方法包括以下步骤：(1)将冰川棘豆材料经液氮研磨后，加入第一裂解液混匀裂解，之后离心取上清液；然后向上清液中加入第二裂解液进行裂解，再离心取上清液；(2)加入氯仿混匀，之后离心取上清液，再向其中加入异丙醇，离心取沉淀；(3)加入乙醇漂洗后，再溶解于DEPC H2O中，低温保存。本发明专利技术通过液氮研磨植物材料结合合理配比的第一裂解液和第二裂解液，能够最大限度提取浓度和纯度更高的RNA样品，为冰川棘豆总RNA基因文库和转录组测序等后续分子生物学的分析奠定重要基础。重要基础。重要基础。

【技术实现步骤摘要】
一种高原植物冰川棘豆总RNA提取的方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，特别是涉及一种高原植物冰川棘豆总RNA提取的方法。

技术介绍

[0002]冰川棘豆(Oxytropis glacialis)是一种有毒植物，冰川棘豆内含有一种叫做苦马豆素的毒性生物碱，动物误食该植物会中毒，目前尚无相关治疗药物。冰川棘豆茎极其短缩或呈无茎状，在青藏高原极端环境下抗逆性较强，如具有抗低氧高寒，抗辐射等特性，相比其他植物可以在局部环境中快速繁殖扩散，并在局部环境形成优势群落，严重威胁生态环境健康和畜牧业的发展。目前针对冰川棘豆的毒性分析正在开展，而分子生物学手段是其中研究的途径之一，但由于高原植物冰川棘豆叶片细胞壁较厚，按照以往植物RNA提取技术来提取冰川棘豆RNA，往往得到的RNA浓度和纯度不高。因此，非常有必要提供一种新的提取冰川棘豆高质量RNA的方法。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种高原植物冰川棘豆总RNA提取的方法，以解决上述现有技术存在的问题，该方法能提取到浓度和纯度更高的RNA样品，为冰川棘豆总RNA基因文库和转录组测序等后续分子生物学的分析奠定重要基础。
[0004]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0005]本专利技术提供一种高原植物冰川棘豆总RNA提取的方法，包括以下步骤：
[0006](1)将冰川棘豆材料经液氮研磨后，加入第一裂解液混匀裂解，之后离心取上清液；然后向上清液中加入第二裂解液进行裂解，再离心取上清液；
[0007](2)向步骤(1)取得的上清液中加入氯仿混匀，之后离心取上清液，再向其中加入异丙醇，离心取沉淀；
[0008](3)向沉淀中加入乙醇漂洗后，再溶解于DEPC H2O中，低温保存；
[0009]所述第一裂解液包括3
‑
4％w/v SDS、2
‑
3％w/v异硫氰酸胍、40
‑
50％v/v苯酚、200
‑
300mmol/L蔗糖；
[0010]所述第二裂解液包括20
‑
30mmol/L EDTA、3
‑
4％w/v PVP、200
‑
250mmol/L NaCl。
[0011]进一步地，步骤(1)所述第一裂解液和所述第二裂解液均与所述冰川棘豆材料比例为5μl：1mg。
[0012]进一步地，步骤(1)所述第一裂解液和所述第二裂解液的pH均调节为6.0。
[0013]进一步地，所述调节具体为采用1M HCl进行调节。
[0014]进一步地，步骤(1)所述裂解条件为冰上静置15min，所述离心具体为12000rpm/min，4℃，离心15min。
[0015]进一步地，步骤(2)所述异丙醇与所述上清液体积比为1：1。
[0016]进一步地，步骤(3)中，将沉淀溶解于DEPC H2O之前，需要将所述沉淀中乙醇吸出
并静置5min。
[0017]进一步地，步骤(3)所述乙醇为体积分数为75％的乙醇。
[0018]本专利技术先将冰川棘豆材料经液氮研磨，充分匀浆，为后续植物细胞与第一裂解液充分接触奠定基础。
[0019]本专利技术的第一裂解液各组分的作用：SDS为阴离子表面活性剂，其对核蛋白质的变性作用和对细胞膜磷脂双分子层的溶解作用，使细胞内的RNA被释放出来。硫氰酸胍、苯酚试剂主要对Rnase产生强烈的抑制作用，从而保证提取RNA的完整性；添加蔗糖以调节溶液渗透压来保护RNA。
[0020]第二裂解液各组分的作用：EDTA和PVP作为优良螯合剂能够螯合金属离子和多酚化合物，有效克服多酚等物质对RNA提取过程的影响；并且NaCl能够保证RNA的稳定性。
[0021]本专利技术采用连续两次裂解，第一裂解液结合充分研磨匀浆的原材料，在保证RNA释放的同时，抑制内源性RNA酶活性，使RNA不易被降解，并辅以渗透压调节剂进一步保护RNA完整性；第二裂解液采用优良螯合剂结合多酚、金属离子等物质，有效避免杂质对RNA提取过程的影响。通过液氮研磨冰川棘豆材料结合连续两次裂解，能够使细胞壁较厚的冰川棘豆叶片细胞破碎，大量释放RNA，同时抑制内源性RNA酶活力，螯合多酚等物质，最大限度提取浓度和纯度较高的高质量RNA。
[0022]本专利技术公开了以下技术效果：
[0023]本专利技术依据高原植物冰川棘豆叶片细胞壁较厚的特点，提供了一种高原植物冰川棘豆总RNA提取的方法，该方法通过液氮研磨植物材料，使其充分匀浆，为后续植物细胞与第一裂解液充分接触奠定基础；且采用连续两次裂解，并辅以合理配比的裂解液各组分，在保证RNA大量释放的同时，抑制内源性RNA酶活力，避免RNA被降解，以及裂解液中优良螯合剂能够螯合金属离子和多酚化合物，有效克服多酚等物质对RNA提取过程的影响，同时添加蔗糖、NaCl渗透压调节剂，保护RNA的完整性和稳定性。而采用常规RNA提取方法提取高原植物冰川棘豆RNA，结果显示，提取的RNA浓度较低，RNA有降解纯度不高，并且最后得到的总RNA量也比较少，证明采用常规RNA提取方法不能获得冰川棘豆的高质量RNA。
[0024]由此可见，本专利技术通过液氮研磨植物材料结合合理配比的第一裂解液和第二裂解液，能够最大限度提取浓度和纯度更高的RNA样品，为冰川棘豆总RNA基因文库和转录组测序等后续分子生物学的分析奠定重要基础。
附图说明
[0025]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0026]图1为实施例1中高原植物冰川棘豆叶片总RNA的凝胶电泳图，其中M：RNA标准品，1：羊八井镇样品(经纬度：90.48799
°
E，30.04268
°
N；海拔4287米)，2：珠峰大本营样品(经纬度：86.84309
°
E，28.16793
°
N；海拔5003米)，3：扎布耶盐湖样品(经纬度：84.02377
°
E，31.39431
°
N；海拔4453米)，4：措勤县扎日南木措样品(经纬度：86.04237
°
E，31.03991
°
N；海拔4710米)。
具体实施方式
[0027]现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0028]应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高原植物冰川棘豆总RNA提取的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将冰川棘豆材料经液氮研磨后，加入第一裂解液混匀裂解，之后离心取上清液；然后向上清液中加入第二裂解液进行裂解，再离心取上清液；(2)向步骤(1)取得的上清液中加入氯仿混匀，之后离心取上清液，再向其中加入异丙醇，离心取沉淀；(3)向沉淀中加入乙醇漂洗后，再溶解于DEPC H2O中，低温保存；所述第一裂解液包括3
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4％w/v SDS、2
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3％w/v异硫氰酸胍、40
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50％v/v苯酚、200
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300mmol/L蔗糖；所述第二裂解液包括20
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30mmol/L EDTA、3
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4％w/v PVP、200
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250mmol/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹鹏熙，拉琼，刘怡萱，马红梅，普顿，刘星，
申请(专利权)人：西藏大学，
类型：发明
国别省市：