一种质粒DNA提取方法技术

本发明专利技术的质粒DNA提取方法，使用设置有由分隔层完全分隔为三个反应腔的释放孔的加样板，在提取质粒DNA时，在悬浮液腔中加入样本；细胞或病毒悬浮后，操作击破与裂解液腔的分隔层，释放出裂解液，裂解细胞或病毒；等待后，再操作击破与中和纯化液腔的分隔层，释放出中和纯化液，中和并沉淀完成后，就获得溶解有复活并提纯后的质粒DNA的第二反应液。然后加入磁珠至释放孔中，磁珠从溶液中吸附质粒DNA，最后磁珠被转移入洗脱液中，将磁珠上吸附的质粒DNA洗脱，从而完成对质粒DNA的提取工作。本发明专利技术的质粒DNA提取方法，将质粒DNA提取时的不同反应液在加样时间上的先后顺序，转换为不同反应腔的空间设置顺序，无须增加移液结构，适合人工或机器全自动操作。人工或机器全自动操作。人工或机器全自动操作。

【技术实现步骤摘要】
一种质粒DNA提取方法


[0001]本专利技术属于分子生物实验
，具体涉及一种质粒DNA提取方法。

技术介绍

[0002]提取细胞或病毒中的质粒/质粒DNA，经常使用强碱裂解法，包括两步：第一步是在细胞或病毒的样本液中，依次加入三种试剂缓冲液：P1、P2、P3，以裂解细胞或病毒，并释放核酸至溶液中。具体地，P1为悬浮液，例如 25 mM Tris
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HCl（pH8.0），10 mM EDTA和50 mM 葡糖糖（Glucose）的混合液，用于将细胞或病毒的个体，悬浮在样本液中。通常P1中还需要预先加入RNA酶 （RNase A）,以清除样本液中的RNA。然后加入P2，即裂解液，使细胞或病毒裂解，具体可选用组份浓度 250 mM的NaOH和1％的（W/V）SDS（十二烷基硫酸钠），其中，氢氧化钠用于裂解细胞或病毒的膜结构，例如使细胞膜发生从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化，从而导致细胞裂解。而SDS则结合裂解后释放出的蛋白质，形成可溶的SDS2多肽复合体，其中的多肽链能更好地缠绕和结合基因组的线型DNA（长链），方便后续去除线型DNA。而P3为中和纯化液，例如选用组份浓度 3M的醋酸钾（potassium acetate）和5M的醋酸，其中，醋酸用于中和氢氧化钠，同时复活质粒DNA，因为质粒DNA为闭环结构，在被强碱失活，碱基对被破坏后，DNA双链仍然缠绕在一起，而当PH降低至恢复中性时，DNA双链之间的碱基配对，就会再次形成，从而恢复质粒DNA的生物活性。而醋酸钾中的钾离子则替换SDS中的钠离子，与SDS结合生成PDS（十二烷基硫酸钾）沉淀，从而去除溶液中的SDS连同缠绕结合的线型DNA。
[0003]当细胞或病毒中的质粒DNA被释放并溶解于水溶液中后，第二步就是使用离心或磁珠对裂解后释放出来的质粒DNA加以收集并提纯。其中，第二步的收集和提纯裂解后释放在溶液中的质粒DNA，现在已经可以由自动化的核酸提取仪来完成。
[0004]现有的核酸提取仪，是应用其配套的核酸提取试剂来自动完成提取释放在样本液中的核酸，包括质粒DNA，的仪器。根据工作原理不同，可以分为离心柱法核酸提取仪和磁珠法核酸提取仪，两个大类。
[0005]其中，磁珠法核酸提取仪，以磁珠为载体，利用磁珠在高盐低PH值下吸附核酸，在低盐高PH值下与核酸分离的原理，再通过移动磁珠或转移液体来实现核酸的整个吸附提取和纯化过程。由于其原理的独特性，所以可设计成很多种通量，既可以单管提取，又可以一次提取8
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96个样本，操作简单快捷，提取96个样本仅需30
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45min，大大提高了实验效率，且成本低廉，可以在不同实验室使用，是目前市场上的主流仪器。
[0006]磁珠法核酸提取仪根据切换工作液体的方式，又分为抽吸法和磁棒法两种，其区别在于，抽吸法是固定磁珠的位置，但使用机械臂来转移与切换不同液体，以浸泡磁珠；而磁棒法，则是移动磁珠至各个固定位置上的液体中。具体为：首先将不同操作阶段的各个液体，包括样本液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液等，依次放置于一多孔加样板上的各个加样孔中，然后控制磁棒，插入磁棒套后，磁棒首先通过磁力吸附磁珠，然后插入样本液中，由磁珠从样本液中吸附以提取核酸，然后在洗涤缓冲液中洗涤磁珠连同吸附于磁珠上的核酸，最后
在洗脱缓冲液中将吸附的核酸从磁珠上洗脱。最后，磁棒提升，磁场撤离，磁珠就自动从磁棒套上落下并被回收。与磁珠法核酸提取仪相适配，通常需要使用一种多孔加样板，即一块板子，其上开有至少一排深孔加样孔（deep well），在核酸提取工作之前，就在所述加样孔中预先放置好相关的试剂缓冲液。这样，磁棒插入磁棒套后，就可以在控制下，携带磁珠，依次插入各个加样孔内的液体中，浸泡磁珠，分别完成吸附、清洗和洗脱核酸的操作，从而富集和提纯核酸。
[0007]现在普遍使用的磁珠法核酸提取仪所使用的深孔板，立体结构如图1所示，上表面均匀分布有多个方形深孔，例如96个，排成规则的12*8阵列，如图2的俯视图所示。这种多孔加样板，因为各个加样孔1是完全等同的，故而对磁棒的移动控制较为简单，只要移动步长配合好各个加样孔1的宽度及间隔距离的大小，就可以做到机械性地、等距离移动磁棒，并可以对应插入至各个加样孔1中。
[0008]但在提取质粒DNA时，因为第一步操作需要先后依次加入P1，P2，P3三种不同的缓冲液，以释放质粒中的环状DNA至溶液中，然后才能执行后续的核酸提取操作。故现有技术中，第一步通常都是在核酸提取仪工作的步骤之前，预先由人工操作，完成质粒DNA的释放工作。然后再将含有释放出来的质粒DNA的溶液放入核酸提取仪中，对其中的质粒DNA加以自动提取，完成第二步操作。故目前大部分的质粒提取仪，并不能够做到完全自动化，直接放入含有待提取质粒的细胞或病毒的样本液，就可以从样本中全自动提取出质粒DNA。当然，也有通过复杂的设计方案来完成全程自动化质粒提取操作的质粒提取仪，通常为增加一移液结构，切换不同液体，以先后侵泡磁珠，从而完成质粒DNA 释放的第一步操作，而这将大大增加专门用于提取质粒DNA的质粒提取仪的成本，并因为零件增加导致故障率增加。
[0009]因此，现有技术有待于进一步改进和提高。

技术实现思路

[0010]有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术的目的在于提供一种质粒DNA提取方法，通过简单操作，包括人工操作或机器操作，就可以一步到位，完成从细胞或病毒到质粒DNA的整个提取过程的自动化。
[0011]本专利技术公开了一种质粒DNA提取方法，提供设有释放孔和洗脱孔的加样板，其中，所述释放孔包括由分隔层完全分隔开的三个反应腔：悬浮液腔、裂解液腔、和中和纯化液腔，分别容纳有使含有待提取质粒的样本悬浮在溶液中的悬浮液、使样本裂解以释放核酸的裂解液、和用于中和所述释放孔中裂解后的反应溶液、并沉降线型DNA以及蛋白质的中和纯化液；所述分隔层易于破开；所述洗脱孔中容纳有洗脱液，用于从磁珠上分离质粒DNA；所述提取方法包括步骤：A. 在所述悬浮液腔中加入所述样本，得到样本悬浮液；B. 等待第一设定时间，击破所述裂解液腔，混合所述样本悬浮液和所述裂解液，得到溶解有释放出的质粒DNA的第一反应液；C. 等待第二设定时间，击破所述中和纯化液腔，混合所述第一反应液和所述中和纯化液，得到溶解有复活并提纯后的质粒DNA的第二反应液；
D. 等待第三设定时间，加入磁珠至所述释放孔，从所述第二反应液中吸附质粒DNA；E. 移动所述磁珠至洗脱孔，从所述磁珠上洗脱分离质粒DNA。
[0012]本专利技术使用悬浮液悬浮含有待提取的质粒的样本，使用裂解液裂解样本，释放核酸，再使用中和纯化液中和裂解液的碱性，复活环状的质粒DNA；同时，将杂质，包括线型DNA和蛋白质，都加以沉淀，以保证溶液中溶解的质粒DNA的纯净。
[0013]优选地，所述分隔层由易于破开的软质惰性材料或薄膜制成。惰性材料，保证不容易与操作过程中的其他化学试剂发生反应，软质使得容易被机械操作本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种质粒DNA提取方法，其特征在于，提供设有释放孔和洗脱孔的加样板，其中，所述释放孔包括由分隔层完全分隔开的三个反应腔：悬浮液腔、裂解液腔、和中和纯化液腔，分别容纳有使含有待提取质粒的样本悬浮在溶液中的悬浮液、使样本裂解以释放核酸的裂解液、和用于中和所述释放孔中裂解后的反应溶液、并沉降线型DNA以及蛋白质的中和纯化液；所述分隔层易于破开；所述洗脱孔中容纳有洗脱液，用于从磁珠上分离质粒DNA；所述提取方法包括步骤：A. 在所述悬浮液腔中加入所述样本，得到样本悬浮液；B. 等待第一设定时间，击破所述裂解液腔，混合所述样本悬浮液和所述裂解液，得到溶解有释放出的质粒DNA的第一反应液；C. 等待第二设定时间，击破所述中和纯化液腔，混合所述第一反应液和所述中和纯化液，得到溶解有复活并提纯后的质粒DNA的第二反应液；D. 等待第三设定时间，加入磁珠至所述释放孔，从所述第二反应液中吸附质粒DNA；E. 移动所述磁珠至洗脱孔，从所述磁珠上洗脱分离质粒DNA。2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述分隔层由易于破开的软质惰性材料或薄膜制成。3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述分隔层为石蜡层。4.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭敏，邹燕，于雪，
申请(专利权)人：康码上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：