用于信使RNA纯化的方法和组合物技术

本发明专利技术特别提供了用于纯化适用于临床用途的高质量信使(mRNA)的方法。本发明专利技术部分基于以下出乎意料的发现，即在pH低于8.0并且MgCl2浓度小于1.25mM的反应缓冲液中对mRNA进行加帽和加尾可以提高最终mRNA产物的RNA完整性。因此，本发明专利技术提供了一种有效、可靠和高效的大规模制造用于治疗用途的高质量RNA的方法。规模制造用于治疗用途的高质量RNA的方法。规模制造用于治疗用途的高质量RNA的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于信使RNA纯化的方法和组合物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年2月10日提交的美国临时申请序列号62/972,471的优先权，该临时申请的公开内容据此以引用的方式并入。

技术介绍

[0003]信使RNA疗法(MRT)是一种很有前途的治疗多种疾病的新方法。MRT涉及将信使RNA(mRNA)施用于需要治疗的患者。所施用的mRNA在患者体内产生由mRNA编码的蛋白质或肽。mRNA通常使用体外转录系统(IVT)来合成，所述体外转录系统涉及通过RNA聚合酶进行的酶促反应。IVT合成过程之后通常是添加5'
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帽(加帽反应)和3'
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多聚
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A尾(聚腺苷酸化)的反应。
[0004]有效的mRNA疗法需要将mRNA有效地递送至患者，并且在患者体内有效地产生由mRNA编码的蛋白质。为了优化体内mRNA递送和蛋白质产生，通常需要在构建体的5'末端设置适当的帽，以保护mRNA免受降解并且促进蛋白质的成功翻译。3
’
末端“尾”的存在用于保护mRNA免受核酸外切酶降解。新型改进方法对于在制造规模上获得用于治疗用途的mRNA是必要的，所述方法可产生高RNA完整性，同时维持高加帽和加尾效率。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种改进的体外转录(IVT)mRNA的制备方法。本专利技术部分基于以下出乎意料的发现：在具有较低pH和较低浓度氯化镁(MgCl2)的反应条件下加帽和加尾的mRNA极大地提高了mRNA产物的RNA完整性，同时维持了所有其他关键质量属性。具体而言，本文公开的加帽和加尾反应条件可以成功地减少最终mRNA产物中的降解的RNA种类。这种独特和有利的加帽和加尾反应条件在本专利技术之前未被理解并且确实出乎意料，尤其是因为优化的加帽和加尾条件能够将mRNA产物的RNA完整性提高至少约25％。基于这种出乎意料的发现，本专利技术人成功地开发了一种合成和纯化具有高RNA完整性的适用于mRNA疗法的mRNA分子的大规模产生方法。因此，本专利技术允许更有效和更可靠地制造用于治疗用途的mRNA。
[0006]在一个方面，本专利技术提供了一种对体外转录的纯化的信使RNA(mRNA)制备物进行加帽和加尾的方法，所述方法包括在包含MgCl2并且pH低于8.0的反应缓冲液中对所述mRNA进行加帽和加尾。
[0007]在一些实施方案中，所述方法包括在包含MgCl2并且pH低于8.0的反应缓冲液中对所述mRNA进行加帽。在一些实施方案中，所述方法包括在包含MgCl2并且pH低于8.0的反应缓冲液中对所述mRNA进行加尾。通常，在包含MgCl2并且pH低于8的反应缓冲液中对所述mRNA进行加帽的步骤以及在包含MgCl2并且pH低于8.0的反应缓冲液中对所述mRNA进行加尾的步骤是分开进行的。一些实施方案中，在包含MgCl2并且pH低于8的反应缓冲液中对所述mRNA进行加帽的步骤以及在包含MgCl2并且pH低于8.0的反应缓冲液中对所述mRNA进行加尾的步骤是按顺序进行的。
[0008]在一些实施方案中，所述反应缓冲液还包含盐。在一些实施方案中，所述反应缓冲液还包含KCl。在一些实施方案中，所述反应缓冲液还包含NaCl。在一些实施方案中，所述反应缓冲液还包含CaCl2。在一些实施方案中，所述反应缓冲液还包含LiCl。在一些实施方案中，所述反应缓冲液还包含乙酸铵。在一些实施方案中，所述反应缓冲液还包含盐的组合。在某个实施方案中，所述反应缓冲液包含浓度范围为0.1mM至100mM的盐。在某个实施方案中，所述反应缓冲液包含浓度范围为1mM至50mM的盐。在某个实施方案中，所述反应缓冲液包含浓度范围为1mM至10mM的盐。在某个实施方案中，所述反应缓冲液包含浓度范围为5mM至8mM的盐。在某个实施方案中，所述反应缓冲液包含浓度为1mM的盐。在某个实施方案中，所述反应缓冲液包含浓度为3mM的盐。在某个实施方案中，所述反应缓冲液包含浓度为5mM的盐。在某个实施方案中，所述反应缓冲液包含浓度为8mM的盐。在某个实施方案中，所述反应缓冲液包含浓度为10mM的盐。
[0009]在一些实施方案中，所述反应缓冲液中的所述MgCl2的浓度约在0.10mM和1.25之间。在一些实施方案中，所述反应缓冲液中的所述MgCl2的浓度约在0.75mM和1.25mM之间。在一些实施方案中，所述反应缓冲液中的所述MgCl2的浓度约在0.50mM和1.0mM之间。在一些实施方案中，所述反应缓冲液中的所述MgCl2的浓度约在0.75mM和1.0mM之间。在一些实施方案中，所述反应缓冲液中的所述MgCl2的浓度为0.25mM。在一些实施方案中，所述反应缓冲液中的所述MgCl2的浓度为0.5mM。在一些实施方案中，所述反应缓冲液中的所述MgCl2的浓度为0.7mM。在一些实施方案中，所述反应缓冲液中的所述MgCl2的浓度为0.75mM。在一些实施方案中，所述反应缓冲液中的所述MgCl2的浓度为0.8mM。在一些实施方案中，所述反应缓冲液中的所述MgCl2的浓度为0.9mM。在一些实施方案中，所述反应缓冲液中的所述MgCl2的浓度为1.0mM。在一些实施方案中，所述反应缓冲液中的所述MgCl2的浓度为1.10mM。在一些实施方案中，所述反应缓冲液中的所述MgCl2的浓度为1.20mM。
[0010]在一些实施方案中，所述反应缓冲液包含MnCl2。在一些实施方案中，所述反应缓冲液包含MgCl2和MnCl2。
[0011]在一些实施方案中，所述反应缓冲液中的所述MnCl2的浓度约在0.10mM和1.25之间。在一些实施方案中，所述反应缓冲液中的所述MnCl2的浓度约在0.75mM和1.25mM之间。在一些实施方案中，所述反应缓冲液中的所述MnCl2的浓度约在0.50mM和1.0mM之间。在一些实施方案中，所述反应缓冲液中的所述MnCl2的浓度约在0.75mM和1.0mM之间。在一些实施方案中，所述反应缓冲液中的所述MnCl2的浓度为0.25mM。在一些实施方案中，所述反应缓冲液中的所述MnCl2的浓度为0.5mM。在一些实施方案中，所述反应缓冲液中的所述MnCl2的浓度为0.7mM。在一些实施方案中，所述反应缓冲液中的所述MnCl2的浓度为0.75mM。在一些实施方案中，所述反应缓冲液中的所述MnCl2的浓度为0.8mM。在一些实施方案中，所述反应缓冲液中的所述MnCl2的浓度为0.9mM。在一些实施方案中，所述反应缓冲液中的所述MnCl2的浓度为1.0mM。在一些实施方案中，所述反应缓冲液中的所述MnCl2的浓度为1.10mM。在一些实施方案中，所述反应缓冲液中的所述MnCl2的浓度为1.20mM。
[0012]在一些实施方案中，所述反应缓冲液的pH在约6.0和8.0之间。在一些实施方案中，所述反应缓冲液的pH在约6.5和8.0之间。在一些实施方案中，所述反应缓冲液的pH在约7.0和7.8之间。在一些实施方案中，所述反应缓冲液的pH在约7.2和7.7之间。在一些实施方案中，所述反应缓冲液的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种对体外转录的纯化的信使RNA(mRNA)制备物进行加帽和加尾的方法，所述方法包括在包含MgCl2并且pH低于8.0的反应缓冲液中对所述mRNA进行加帽和加尾。2.如权利要求1所述的方法，其中所述反应缓冲液还包含KCl。3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反应缓冲液中的所述MgCl2的浓度约在0.75mM和1.25mM之间。4.如权利要求3所述的方法，其中所述反应缓冲液中的所述MgCl2的浓度为约1.0mM。5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反应缓冲液中的所述MgCl2的浓度为1.0mM。6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反应缓冲液的pH在约7.2和7.7之间。7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反应缓冲液的pH为约7.5。8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA的规模为5mg、1g、15g、100g、250g、500g或1kg或更大。9.如权利要求8所述的方法，其中所述mRNA的规模为100g。10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中对所述mRNA进行加尾包括添加长度约在250个核苷酸和750个核苷酸之间的多聚
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A尾。11.如权利要求10所述的方法，其中对所述mRNA进行加尾包括添加长度为约500个核苷酸的多聚
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A尾。12.如权利要求10或11所述的方法，其中对所述mRNA进行加尾的效率在约70％和95％之间。13.如权利要求12所述的方法，其中对所述mR...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：翻译生物公司，
类型：发明
国别省市：