【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】编码SARS
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COV
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2抗原的优化核苷酸序列
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2020年5月7日提交的美国临时专利申请序列号63/021,319、2020年6月1日提交的美国临时专利申请序列号63/032,825、2020年9月10日提交的美国临时专利申请序列号63/076,718、2020年9月10日提交的美国临时专利申请序列号63/076,729、2020年10月7日提交的美国临时专利申请序列号63/088,739、2021年1月29日提交的美国临时专利申请序列号63/143,604、2021年1月29日提交的美国临时专利申请序列号63/143,612和2021年2月8日提交的美国临时专利申请序列号63/146,807的权益和优先权,将其内容以其整体并入本文。序列表
[0002]本说明书参考了序列表(在2021年5月7日以名为MRT
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2161WO_SL的.txt文件的电子形式提交)。所述.txt文件在日期生成并且大小为757KB。将序列表的全部内容通过引用并入本文。
[0003]本专利技术涉及SARS
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CoV
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2抗原多肽以及编码这些SARS
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CoV
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2抗原多肽的优化核苷酸序列。这些抗原多肽和优化核苷酸序列特别适用于疫苗组合物,所述疫苗组合物用于治疗或预防需要这种治疗的人或动物受试者的由β
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冠状病毒引起的感染,包括COVID
‑r/>19感染。
技术介绍
[0004]冠状病毒疾病2019(COVID
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19)大流行对全球公共卫生构成严重威胁。COVID
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19的致病因子是严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS
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CoV
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2),这是一种新出现的人类病原体。
[0005]蛋白质抗原的选择和设计都有助于疫苗的免疫原性,无论它是基于蛋白质的还是基于核酸的。此外,关于基于核酸的免疫原性组合物,诸如基于mRNA的疫苗,从编码一种或多种蛋白质抗原的核酸获得的表达水平可以显著影响功效。
[0006]重组DNA技术以及核酸测序和合成技术的进步使得一旦确定病原体的基因组序列就有可能快速设计蛋白质抗原。疫苗的成功或失败可以取决于体内产生中和抗体形式的高效反应的抗原多肽的选择。因此,需要提供源自SARS
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CoV
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2蛋白的新抗原多肽,用于针对COVID
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19提供预防的免疫原性组合物。
[0007]在细胞内从mRNA有效表达或产生蛋白质取决于多种因素。编码蛋白质的核苷酸序列中密码子的组成和顺序的优化(“密码子优化”)可以导致mRNA编码的蛋白质的更高表达。进行密码子优化的各种方法是本领域中已知的,然而,从计算和/或治疗的角度来看,每种方法都有显著的缺点和局限性。特别地,已知的密码子优化方法通常涉及对于每种氨基酸,将每种密码子用对该氨基酸具有最高使用率的密码子替代,使得“优化”序列仅含有一种密码子编码每种氨基酸。
[0008]因此,需要改善的密码子优化方法,其产生优化核苷酸序列,用于增加编码所选择
或设计的蛋白质抗原的mRNA的表达,用于生产有效mRNA疫苗。
[0009]此外,随着SARS
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CoV
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2在全球的传播,已出现新的病毒变体。因此,需要提供能够引发广泛中和抗体反应的药物组合物(例如,免疫原性组合物),所述反应有效针对SARS
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CoV
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2的多种天然存在的变体。
技术实现思路
[0010]本专利技术解决了选择和/或设计针对SARS
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CoV
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2产生有效免疫反应的蛋白质抗原的需要。本专利技术还解决了产生编码该蛋白抗原的优化核苷酸序列的需要,以通过提供包含具有优化核苷酸序列的核酸(例如,mRNA)的疫苗来有效治疗或预防COVID
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19感染。本文提供了针对SARS
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CoV
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2的各种选择和/或设计的蛋白质抗原以及针对每种此类蛋白质抗原的至少一个优化核苷酸序列。
[0011]另外,提供了一种用于分析蛋白质抗原的氨基酸序列以产生至少一个优化核苷酸序列的方法。针对每种选择和/或设计的蛋白质抗原的优化核苷酸序列被设计成与天然存在的核苷酸序列相关的蛋白质的表达相比增加该编码的蛋白质抗原的表达。密码子优化基于各种标准产生编码蛋白质的核苷酸序列,而不改变编码蛋白质抗原的翻译氨基酸的序列,这是由于遗传密码的冗余。此外,此处公开的优化核苷酸序列被设计成在体外合成期间产生高质量全长转录物,并且因此可以比用现有技术密码子优化算法产生的优化核苷酸序列更具成本效益地制造。特别地,通过本文所述的序列优化过程,可以有效地去除在体外合成期间可能导致不完整转录物的终止序列及类似物。
[0012]如实施例中所证明,包含LNP包封的编码全长融合前稳定化SARS
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CoV
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2 S蛋白的本专利技术优化核苷酸序列的免疫原性组合物可以产生有效的中和抗体反应,并且因此可以提供针对COVID
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19感染的保护功效。
[0013]本专利技术还解决了对免疫原性组合物的需求,所述免疫原性组合物能够针对SARS
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CoV
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2的天然存在的变体引发广泛有效的免疫反应,特别是呈中和抗体的形式。如实施例中所示,诸位专利技术人令人惊讶地发现,向先前用COVID
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19疫苗免疫的受试者施用包含LNP包封的编码SARS
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CoV
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2 S蛋白的南非变体的优化核苷酸序列的免疫原性组合物可以针对宽范围的β
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冠状病毒诱导有效的中和抗体反应,所述β
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冠状病毒包括南非、日本/巴西和加利福尼亚分离的SARS
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CoV
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2的天然存在的变体以及在系统发育上更遥远的SARS
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CoV
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1毒株。
[0014]特别地,本专利技术提供了一种核酸,所述核酸包含编码全长SARS
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CoV
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2刺突蛋白的优化核苷酸序列,所述刺突蛋白相对于SEQ ID NO:1的天然存在的全长SARS
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CoV
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2刺突蛋白已被修饰为去除弗林蛋白酶切割位点并且使残基986和987突变为脯氨酸,其中所述优化核苷酸序列由与大于或等于10%的使用频率相关的密码子组成;其中所述优化核苷酸序列:不含具有以下核苷酸序列之一的终止信号:5
’‑
X1ATCTX2TX3‑3’
,其中X1、X2和X3独立地选自A、C、T或G;以及5
’‑
X1AUCUX2UX3‑3’<本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种核酸,所述核酸包含编码全长SARS
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CoV
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2刺突蛋白的优化核苷酸序列,所述刺突蛋白相对于SEQ ID NO:1的天然存在的全长SARS
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CoV
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2刺突蛋白已被修饰为去除弗林蛋白酶切割位点并且使残基986和987突变为脯氨酸,其中所述优化核苷酸序列由与大于或等于10%的使用频率相关的密码子组成;其中所述优化核苷酸序列:(i)不含具有以下核苷酸序列之一的终止信号:5
’‑
X1ATCTX2TX3‑3’
,其中X1、X2和X3独立地选自A、C、T或G;以及5
’‑
X1AUCUX2UX3‑3’
,其中X1、X2和X3独立地选自A、C、U或G;(ii)不含任何负顺式调控元件和负重复元件;以及(iii)具有大于0.8的密码子适应指数;其中当分成不重叠的30个核苷酸长的部分时,所述优化核苷酸序列的每个部分具有30%
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70%的鸟嘌呤胞嘧啶含量范围。2.根据权利要求1所述的核酸,其中所述优化核苷酸序列不含具有以下序列之一的终止信号:TATCTGTT;TTTTTT;AAGCTT;GAAGAGC;TCTAGA;UAUCUGUU;UUUUUU;AAGCUU;GAAGAGC;UCUAGA。3.根据权利要求1或2所述的核酸,其中由所述优化序列编码的全长SARS
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CoV
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2刺突蛋白进一步含有L18F、D80A、D215G、L242
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、A243
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、L244
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、K417N、E484K、N501Y、D614G和A701V突变。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的核酸,其中所述核酸是mRNA。5.根据权利要求1
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3中任一项所述的核酸,其中所述核酸是DNA。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的核酸,其中所述优化核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列,任选地其中所述优化核苷酸序列具有核酸序列SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:148。7.根据权利要求1
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5中任一项所述的核酸,其中所述优化核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列,任选地其中所述优化核苷酸序列具有核酸序列SEQ ID NO:166或SEQ ID NO:173。8.根据权利要求1
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7中任一项所述的核酸,所述核酸用于疗法。9.一种免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含根据权利要求1
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7中任一项所述的核酸,用于预防由β
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冠状病毒引起的感染。10.根据权利要求9所述的用于所述用途的免疫原性组合物,其中所述β
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冠状病毒表达结合血管紧张素转化酶2(ACE2)的刺突蛋白。11.根据权利要求9或权利要求10所述的用于所述用途的免疫原性组合物,其中所述β
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冠状病毒是SARS
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CoV
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2。12.根据权利要求9
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11所述的用于所述用途的免疫原性组合物,其中所述β
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冠状病毒具有与SEQ ID NO:1至少75%、80%、90%、95%或99%相同的刺突蛋白。13.一种治疗或预防由β
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冠状病毒引起的感染的方法,所述方法包括向受试者施用有效量的免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含根据权利要求1
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7中任一项所述的核酸。14.根据权利要求13所述的方法,其中,所述β
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冠状病毒表达结合血管紧张素转化酶2(ACE2)的刺突蛋白。15.根据权利要求13或权利要求14所述的方法,其中所述β
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冠状病毒是SARS
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CoV
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2。
16.根据权利要求13
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15所述的方法,其中所述β
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冠状病毒具有与SEQ ID NO:1至少75%、80%、90%、95%或99%相同的刺突蛋白。17.一种药物组合物,所述药物组合物包含i)根据权利要求1
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7中任一项所述的核酸,和ii)脂质纳米颗粒。18.根据权利要求17所述的药物组合物,其中所述核酸被包封在所述脂质纳米颗粒中。19.根据权利要求17或权利要求18所述的药物组合物,其中所述脂质纳米颗粒包含阳离子脂质、非阳离子脂质、基于胆固醇的脂质、和PEG修饰的脂质。20.根据权利要求19所述的药物组合物,其中a.所述阳离子脂质选自cKK
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E12、cKK
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E10、OF
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Deg
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Lin和OF
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02;b.所述非阳离子脂质选自DOPE和DEPE;c.所述基于胆固醇的脂质是胆固醇;以及d.所述PEG修饰的脂质是DMG
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PEG
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2K。21.根据权利要求19或20所述的药物组合物,其中阳离子脂质占所述脂质纳米颗粒的按摩尔比计约30%
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60%,例如约35%
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40%。22.根据权利要求19
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21中任一项所述的药物组合物,其中阳离子脂质与非阳离子脂质与基于胆固醇的脂质与PEG修饰的脂质的比率是按摩尔比计大约30
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60:25
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35:20
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30:1
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15。23.根据权利要求19
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22中任一项所述的药物组合物,其中所述脂质纳米颗粒包含cKK
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E12、DOPE、胆固醇和DMG
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PEG2K;cKK
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E10、DOPE、胆固醇和DMG
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PEG2K;OF
‑
Deg
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Lin、DOPE、胆固醇和DMG
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PEG2K;或OF
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02、DOPE、胆固醇和DMG
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PEG2K。24.根据权利要求19
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23中任一项所述的药物组合物,其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为40:30:28.5:1.5的cKK
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E10、DOPE、胆固醇和DMG
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PEG2K。25.根据权利要求17
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24中任一项所述的药物组合物,其中所述脂质纳米颗粒的平均尺寸小于150nm,例如小于100nm。26.根据权利要求25所述的药物组合物,其中所述脂质纳米颗粒的平均尺寸为约50
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70nm,例如约55
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65nm。27.根据权利要求17
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26中任一项所述的药物组合物,其中所述核酸是浓度在约0.5mg/mL至约1.0mg/mL之间的mRNA。28.根据权利要求17
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27中任一项所述的药物组合物,所述药物组合物用于治疗或预防由β
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冠状病毒引起的感染。29.根据权利要求28所述的用于所述用途的药物,其中所述β
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冠状病毒表达结合血管紧张素转化酶2(ACE2)的刺突蛋白。30.根据权利要求28或权利要求29所述的用于所述用途的药物组合物,其中所述β
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冠状病毒是SARS
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CoV
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2。31.根据权利要求28至30所述的用于所述用途的药物组合物,其中所述β
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冠状病毒具有与SEQ ID NO:1至少75%、80%、90%、95%或99%相同的刺突蛋白。32.根据权利要求28
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31所述的用于所述用途的药物组合物,其中所述药物组合物是肌内施用的。33.根据权利要求32所述的用于所述用途的药物组合物,其中所述药物组合物施用至
少一次。34.根据权利要求33所述的用于所述用途的药物组合物,其中所述药物组合物施用至少两次。35.根据权利要求34所述的用于所述用途的药物组合物,其中施用之间的时间段是至少2周,例如3周或1个月。36.一种mRNA构建体,所述mRNA构建体由以下结构元件组成:(i)具有以下结构的5
’
帽:(ii)具有核酸序列SEQ ID NO:144的5
’
非翻译区(5
’
UTR);(iii)具有核酸序列SEQ ID NO:148的蛋白质编码区;(iv)具有核酸序列SEQ ID NO:145的3
’
非翻译区(3
’
UTR);以及(v)聚A尾。37.一种mRNA构建体,所述mRNA构建体由以下结构元件组成:(i)具有以下结构的5
’
帽:(ii)具有核酸序列SEQ ID NO:144的5
’
非翻译区(5
’
UTR);(iii)具有核酸序列SEQ ID NO:173的蛋白质编码区;(iv)具有核酸序列SEQ ID NO:145的3
’
非翻译区(3
’
UTR);以及(v)聚A尾。38.一种脂质纳米颗粒,所述脂质纳米颗粒包封根据权利要求36所述的mRNA构建体。39.一种脂质纳米颗粒,所述脂质纳米颗粒包封根据权利要求37所述的mRNA构建体。40.一种脂质纳米颗粒,所述脂质纳米颗粒包封根据权利要求36所述的mRNA构建体和根据权利要求37所述的mRNA构建体。41.根据权利要求38
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40中任一项所述的脂质纳米颗粒,其中所述脂质纳米颗粒包含阳离子脂质、非阳离子脂质、基于胆固醇的脂质、和PEG修饰的脂质。42.根据权利要求41所述的脂质纳米颗粒,其中所述阳离子脂质选自cKK
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E12、cKK
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E10、OF
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Deg
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Lin和OF
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02;所述非阳离子脂质选自DOPE和DEPE;所述基于胆固醇的脂质是胆固醇;并且所述PEG修饰的脂质是DMG
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PEG
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2K。43.根据权利要求42所述的脂质纳米颗粒,其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为40:
30:28.5:1.5的cKK
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E10、DOPE、胆固醇和DMG
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PEG2K。44.一种免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含根据权利要求36所述的mRNA构建体和/或根据权利要求37所述的mRNA构建体或根据权利要求38
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43中任一项所述的脂质纳米颗粒。45.根据权利要求44所述的免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含5μg与200μg之间的所述一种或多种mRNA构建体。46.根据权利要求45所述的免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含7μg与135μg之间的所述一种或多种mRNA构建体。47.根据权利要求46所述的免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含至少10μg的所述一种或多种mRNA构建体。48.根据权利要求46所述的免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含至少15μg的所述一种或多种mRNA构建体。49.根据权利要求46所述的免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含至少20μg的所述一种或多种mRNA构建体。50.根据权利要求46所述的免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含至少25μg的所述一种或多种mRNA构建体。51.根据权利要求46所述的免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含至少35μg的所述一种或多种mRNA构建体。52.根据权利要求46所述的免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含至少40μg的所述一种或多种mRNA构建体。53.根据权利要求46所述的免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含至少45μg的所述一种或多种mRNA构建体。54.根据权利要求46所述的免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含7.5μg、15μg、45μg或135μg的所述一种或多种mRNA构建体。55.一种治疗或预防由β
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冠状病毒引起的感染的方法,所述方法包括向受试者施用有效量的根据权利要求44至54中任一项所述的免疫原性组合物。56.根据权利要求55所述的方法,其中,所述β
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冠状病毒表达结合血管紧张素转化酶2(ACE2)的刺突蛋白。57.根据权利要求55或权利要求56所述的方法,其中所述β
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冠状病毒是SARS
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CoV
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2。58.根据权利要求55至57中任一项所述的方法,其中所述β
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冠状病毒具有与SEQ ID NO:1至少75%、80%、90%、95%或99%相同的刺突蛋白。59.根据权利要求55
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58中任一项所述的方法,其中向所述受试者至少两次施用所述免疫原性组合物。60.根据权利要求59所述的方法,...
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