用于测量聚制造技术

本发明专利技术尤其提供了测量包括

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于测量聚A尾长度的方法
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求
2021
年4月
29
日提交的美国临时专利申请序列号
63/181,488
的优先权，将其通过引用以其整体出于所有目的并入本文
。
通过引用并入序列表
[0002]将在
2022
年4月
15
日创建并且大小为
688
字节的名为“MRT
‑
2220WO1_ST25.txt”的文本文件的内容通过引用以其整体特此并入
。

技术介绍

[0003]信使
RNA
疗法
(MRT)
是治疗各种疾病的有前景的方法
。MRT
涉及向需要此疗法的患者施用信使
RNA(mRNA)。
施用的
mRNA
在患者体内产生由
mRNA
编码的蛋白质或肽
。
通常使用涉及由
RNA
聚合酶进行的酶促反应的体外转录系统
(IVT)
合成
mRNA。IVT
合成过程之后通常是用于添加
5'
‑
帽
(
加帽反应
)
和
3'
‑
聚
A
尾
(
多腺苷酸化
)
的一种或多种反应
。
[0004]有效的
mRNA
疗法需要向患者递送
mRNA
并在患者体内高效产生由该
mRNA
编码的蛋白质
。5'
帽和
3'
聚
A
尾在优化
mRNA
递送和体内蛋白质产生中起作用
。5'
端的帽防止降解并改善翻译
。3'
端的聚
A
尾保护
mRNA
免受外切核酸酶降解，并改善用于
mRNA
治疗剂的
mRNA
的完整性和稳定性
。

技术实现思路

[0005]进行聚
A
尾长度的评估作为用于
mRNA
治疗剂的质量控制测量
。
准确的聚
A
尾长度测量也用于通过准确定量稳定的
mRNA
治疗剂来确定剂量，该
mRNA
治疗剂是完整的
、
全长的并且在递送后翻译成功能性蛋白
。
当前可用的确定聚
A
尾长度的方法具有某些缺点，包括低准确度等
。
[0006]用于确定聚
A
尾长度的当前方法包括例如使用聚
A
结合蛋白测定来测量，该聚
A
结合蛋白测定需要足够长的聚
A
尾以结合聚
A
结合蛋白的至少4个单体，其中每个单体结合大约
38
个核苷酸的延伸段
。
其他方法包括使用基于
PCR
测定的由连接介导的聚
A
测量，所述
PCR
测定需要逆转录步骤和从寡聚
dT
引物进行
cDNA
合成，该测量对于较长的聚
A
尾可能是不准确的
。
另一种方法，基于
RNase H
的方法涉及从目的
mRNA
中除去聚
A
尾，这不适合于需要完整聚
A
尾的
mRNA
治疗剂
。
[0007]用于测量
mRNA
治疗剂的
mRNA
尾长度的方法包括例如毛细管电泳
(CE)
方法和
RNase A
方法
。
[0008]所述
CE
方法不需要酶消化，并且在约1小时的短运行时间内完成
。
该方法可以以高通量的方式采用，其中可以同时处理多达
48
个样品
。
然而，随着尾长度增加，测量的尾长度通常不准确，因为毛细管电泳中的保留时间发生变化
。CE
方法通常采用嵌入染料如
Agilent
TM
嵌入染料，其导致与包括聚
A
尾在内的同聚延伸段形成弱信号
。
[0009]RNase A
凝胶方法需要允许在
C
和
U
之后进行特异性降解的酶消化，留下待测量的聚
A
尾
。
该方法提供了对尾长度的可再现且一致的测量
。
然而，该方法需要
30
分钟的酶消化
步骤和2小时
30
分钟的凝胶运行时间
。
此方法以约
10
个样品
/
凝胶的低通量方式进行
。
[0010]本专利技术尤其提供了一种以快速且高通量的方式准确测量
mRNA
样品中聚
A
尾长度的方法
。
本专利技术部分基于以下出人意料且意外的发现，即小沟结合染料与
mRNA
结合
、
随后进行核糖核酸酶
(RNase)
消化和毛细管电泳
(CE)
提供了确定
mRNA
的聚
A
尾长度的准确方法
。
在一些实施方案中，所述方法的一个或多个步骤是自动化的
。
在一些实施方案中，所述方法是高通量的
。
[0011]使用目前的方法准确测量
50
至
200
或更多个核苷酸之间的长聚
A
尾长度是具有挑战性的
。
本文提供了一种方法，所述方法可以以高效且高通量的方式可靠且准确地测量
50
或更多个
、100
或更多个
、150
或更多个或
200
或更多个核苷酸的长聚
A
尾长度
。
在一些实施方案中，使用此方法测量的聚
A
尾长度等于理论尾长度
。
在一些实施方案中，测量的尾长度是
100
％准确的
。
在一些实施方案中，使用此方法测量的聚
A
尾长度接近理论尾长度
。
在一些实施方案中，测量的聚
A
尾长度是大于
90
％
、
大于
91
％
、
大于
92
％
、
大于
93
％
、
大于...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
一种测量
mRNA
样品中聚
A
尾长度的方法，所述方法包括：
(a)
使所述
mRNA
样品与小沟结合染料接触；
(b)
将来自
(a)
的所述
mRNA
样品与一种或多种核糖核酸酶
(RNase)
一起孵育；以及
(c)
通过毛细管电泳
(CE)
测定来自
(b)
的所述样品以确定所述
mRNA
的聚
A
尾长度
。2.
根据权利要求1所述的方法，其中所述小沟结合染料是
Sybr gold
TM
、Hoechst
染料
、
或
4',6
‑
二脒基
‑2‑
苯基吲哚
(DAPI)。3.
根据权利要求2所述的方法，其中所述小沟结合染料是
Sybr gold
TM
。4.
根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种
RNase
选自
RNase A
和
RNase T1。5.
根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种
RNase
包含
RNaseA
和
RNase T1。6.
根据权利要求1所述的方法，其中所述
CE
与基于荧光的检测偶联
。7.
根据权利要求1所述的方法，其中所述
CE
与
UV
吸收光谱法检测偶联
。8.
根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将来自
(a)
的所述
mRNA
样品与一种或多种核糖核酸酶
(RNase)
一起孵育约
15
分钟
、30
分钟
、45
分钟或
60
分钟
。9.
根据权利要求8所述的方法，其中将来自
(a)
的所述
mRNA
样品与一种或多种核糖核酸酶
(RNase)
一起孵育约
30
分钟
。10.
根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述聚
A
尾长度为
25
个核苷酸或更多
。11.
根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述聚
A
尾长度在
50
个核苷酸与
5,000
个核苷酸之间
。12.
根据权利要求
11
所述的方法，其中所述聚
A
尾长度为
50
或更多个核苷酸
、100
或更多个核苷酸
、150
或更多个核苷酸
、
或
200
或更多个核苷酸
。13.
根据权利要求
11
所述的方法，其中所述聚
A
尾长度在
100
个核苷酸与
1,500
个核苷酸之间
。14.
根据权利要求
13
所述的方法，其中所述聚
A
尾长度在
250
个核苷酸与
500
个核苷酸之间
。15.
根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法的一个或多个步骤是自动化的
。16.
根据权利要求
14
所述的方法，其中将来自
(a)
的所述
mRNA
样品与一种或多种核糖核酸酶
(RNase)
一起孵育是自动化的
。17.
根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述小沟结合染料非共价结合单链
RNA(ssRNA)。18.
根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述小沟结合染料不是嵌入染料

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：翻译生物公司，
类型：发明
国别省市：