用于纯化信使制造技术

本发明专利技术部分涉及使用在较低重力下运行的过滤离心机大规模纯化

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于纯化信使RNA的方法
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求
2020
年
10
月1日提交的美国临时申请序列号
63/086,095
的优先权，将所述申请的公开内容通过引用特此并入
。

技术介绍

[0002]信使
RNA(mRNA)
治疗药是有前途的新型治疗剂；例如，
mRNA
替代治疗药可以是传统蛋白质替代疗法的替代方案
。
在
mRNA
替代治疗药中，将编码特定蛋白质序列的完整
mRNA
递送至靶细胞，并且通过细胞的天然翻译机制翻译成完整蛋白质
。
用于此类治疗药的
mRNA
典型地是这样合成的，使用体外转录系统用酶
(
诸如
RNA
聚合酶
)
从模板
(
诸如质粒
DNA)
转录
mRNA
，同时或随后添加
5'
‑
帽和
3'
‑
聚腺苷酸化
。
此类反应的结果是包含全长
mRNA
和各种不期望的污染物
(
例如，蛋白质
、
盐
、
缓冲剂和非
RNA
核酸
)
的组合物，所述污染物典型地被去除以提供可用于
mRNA
替代治疗药的洁净且均匀的
mRNA。
[0003]传统上，通过可商购的基于二氧化硅的柱系统
(
诸如
Qiagen 试剂盒
)
或者通过将蛋白质提取到有机混合物
(
苯酚
:
氯仿
:
异戊醇
)
中并且随后进行乙醇沉淀，从体外转录反应中纯化
mRNA。
这些方法在规模上是有限制性的，因为它们可以提供最多5至
10mg
洁净且均匀的
mRNA
；因此，它们不足以满足
mRNA
的临床和商业用途的需要
。
最近的新颖方法
(
诸如切向流过滤
(TFF))
已经被修改为从体外转录反应中纯化沉淀
mRNA
；这大大增加了纯化的规模
。
适用于大规模纯化
mRNA
的另外的方法可用于
mRNA
治疗药的临床和商业开发
。
例如，另一种方法使用过滤离心
。
然而，这些方法中的许多方法在纯化过程中需要大体积的洗涤缓冲剂，以实现适用于临床制剂的洗涤效率
。
鉴于安全法规
(
其限制了可储存于设施中的易燃溶剂的量
)
，这些大体积的洗涤缓冲剂
(
通常包括乙醇
)
使批量大小受到限制
。
因此，这些已知的方法在不重新配置现有设施的情况下通常只能用于较小的批量大小
。
[0004]因此，需要一种有成本效益方式且可扩大的方法，其避免了现有技术方法的缺点，并且产生具有治疗用途可接受的纯度和完整性水平的洁净且均匀的
mRNA
组合物
。

技术实现思路

[0005]本专利技术尤其提供了一种纯化信使
RNA(mRNA)
的高效且有成本效益的方法
。
所述方法涉及使不纯的
RNA
制剂沉淀，并且使用过滤离心机对其进行纯化
。
本专利技术部分基于这样一个出乎意料的发现，即将包含沉淀
mRNA
的悬浮液加载到过滤离心机中并且洗涤所保留的沉淀
mRNA
可以以比先前使用的离心机速度更低的离心机速度进行
。
特别地，加载步骤可以以较低的离心机速度进行，同时仍确保
mRNA
可以被有效地洗涤和纯化
。
这是违反直觉的，因为较高的离心机速度在本领域中用于加载过滤离心机
。
人们认为，较高的速度是确保悬浮液中沉淀
mRNA
被过滤器有效地保留从而避免所得滤饼被逐出所必要的
。
出乎意料地是，诸位专利技术人发现，在加载步骤和洗涤步骤中均使用较低的离心机速度降低了纯化过程期间所需的挥发性有机溶剂
(
例如，乙醇
)
的体积
。
确实，在本专利技术的一些方面，在使用较低的速度来加载和洗涤沉淀
mRNA
时可以完全避免使用挥发性有机溶剂
(
例如，乙醇
)。
根据这些观察结
果，与先前的方法相比，本专利技术的方法可以在加载和洗涤步骤两者中使用相同的较低离心机速度，简化和自动化纯化过程，这两者均有助于增加可扩大性
。
因此，本专利技术提供了一种纯化
mRNA
的有效
、
可靠且更安全的方法，所述方法可以适用于使用现有制造设施的大规模制造过程，提供非常高产率的具有临床级完整性和纯度的
mRNA。
[0006]在一方面，本专利技术提供了一种用于纯化信使
RNA(mRNA)
的方法，所述方法包括以下步骤：
a)
使
mRNA
从包含来自所述
mRNA
的制造的一种或多种蛋白质和
/
或短流产性转录物污染物的溶液中沉淀，以提供包含沉淀
mRNA
的悬浮液；
b)
将包含所述沉淀
mRNA
的悬浮液加载到包含过滤器的过滤离心机中，其中所述沉淀
mRNA
被所述过滤器保留；
c)
通过向所述过滤离心机中添加洗涤缓冲剂来洗涤所保留的沉淀
mRNA
；以及
d)
从所述过滤器中回收所保留的沉淀
mRNA
，其中在加载步骤
(b)
和洗涤步骤
(c)
期间使所述过滤离心机以施加小于
1300g
的重力
(g)
的离心机速度运行
。
[0007]在一些实施方案中，所述离心机速度施加在约
150g
与约
1300g
之间的重力
(g)。
在一些实施方案中，所述离心机速度施加在约
300g
与约
1300g
之间，例如在约
400g
与约
1100g
之间的重力
(g)。
在一些实施方案中，所述离心机速度施加在约
500g
与约
900g
之间，例如在约
550g
与约
850g
之间的重力
(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
一种用于纯化信使
RNA(mRNA)
的方法，所述方法包括以下步骤：
I.
使
mRNA
从包含来自所述
mRNA
的制造的一种或多种蛋白质和
/
或短流产性转录物污染物的溶液中沉淀，以提供包含沉淀
mRNA
的悬浮液；
II.
将包含所述沉淀
mRNA
的悬浮液加载到包含过滤器的过滤离心机中，其中所述沉淀
mRNA
被所述过滤器保留；
III.
通过向所述过滤离心机中添加洗涤缓冲剂来洗涤所保留的沉淀
mRNA
；以及
IV.
从所述过滤器中回收所保留的沉淀
mRNA
；其中在加载步骤
(b)
和洗涤步骤
(c)
期间使所述过滤离心机以施加小于
1300g
的重力
(g)
的离心机速度运行
。2.
根据权利要求1所述的方法，其中离心机速度施加在约
300g
与约
1300g
之间，例如在约
400g
与约
1100g
之间的重力
(g)。3.
根据权利要求2所述的方法，其中离心机速度施加在约
500g
与约
900g
之间，例如在约
700g
与约
900g
之间，例如在约
750g
与
850g
之间
(
例如，约
800g)
的重力
(g)。4.
根据权利要求2所述的方法，其中离心机速度施加在约
550g
与约
750g
之间，例如在约
650g
与约
750g
之间的重力
(g)。5.
根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在加载步骤
(b)
和洗涤步骤
(c)
期间使所述过滤离心机以相同的离心机速度运行
。6.
根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中从所述过滤器中回收所保留的沉淀
mRNA
包括以下步骤：
i.
使所保留的沉淀
mRNA
溶解；以及
ii.
收集所溶解的
mRNA。7.
根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述
mRNA
的沉淀包括添加一种或多种促进
mRNA
沉淀的试剂，例如醇
、
两亲性聚合物
、
缓冲剂
、
盐和
/
或表面活性剂中的一种或多种
。8.
根据权利要求7所述的方法，其中所述一种或多种促进所述
mRNA
沉淀的试剂是：
i.
盐，和
ii.
醇或两亲性聚合物
。9.
根据权利要求7或8所述的方法，其中所述醇是乙醇
。10.
根据权利要求7‑9中任一项所述的方法，其中所述盐是离液盐
。11.
根据权利要求
10
所述的方法，其中所述盐的最终浓度为2‑
4M
，例如为
2.5
‑
3M。12.
根据权利要求
11
所述的方法，其中所述盐的最终浓度为约
2.7M。13.
根据权利要求
10
‑
12
中任一项所述的方法，其中所述离液盐是硫氰酸胍鎓
(GSCN)。14.
根据权利要求
7、8
或
10
‑
13
所述的方法，其中所述两亲性聚合物选自普朗尼克
、
聚乙烯吡咯烷酮
、
聚乙烯醇
、
聚乙二醇
(PEG)、
三乙二醇单甲醚
(MTEG)
或其组合
。15.
根据权利要求
14
所述的方法，其中所述
PEG
的分子量为约
200
至约
40,000g/mol。16.
根据权利要求
15
所述的方法，其中所述
PEG
的分子量为约
200
‑
600g/mol、
约
2000
‑
10000g/mol
或约
4000
‑
8000g/mol。17.
根据权利要求
16
所述的方法，其中所述
PEG
的分子量为约
6000g/mol(
例如，
PEG
‑
6000)。
18.
根据权利要求
14
‑
17
中任一项所述的方法，其中所述
PEG
的最终浓度为约
10
％至约
100
％重量
/
体积
。19.
根据权利要求
18
所述的方法，其中所述
PEG
的最终浓度为约
50
％重量
/
体积
。20.
根据权利要求
19
所述的方法，其中所述
PEG
的最终浓度小于
25
％重量
/
体积
。21.
根据权利要求
20
所述的方法，其中所述
PEG
的最终浓度为约5％至
20
％重量
/
体积
。22.
根据权利要求
21
所述的方法，其中所述
PEG
的最终浓度为约
10
％至
15
％重量
/
体积
。23.
根据权利要求
7、8
或
10
‑
14
所述的方法，其中所述两亲性聚合物是
MTEG。24.
根据权利要求
23
所述的方法，其中所述
MTEG
的最终浓度为约
10
％至约
100
％重量
/
体积的浓度
。25.
根据权利要求
24
所述的方法，其中所述
MTEG
的最终浓度为约
15
％至约
45
％重量
/
体积，例如约
20
％至约
40
％重量
/
体积
。26.
根据权利要求
25
所述的方法，其中所述
MTEG
的最终浓度为约
20
％
、
约
25
％
、
约
30
％或约
35
％重量
/
体积
。27.
根据权利要求
26
所述的方法，其中所述
MTEG
的最终浓度为约
25
％重量
/
体积
。28.
根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述悬浮液包含沉淀
mRNA、
盐和
MTEG。29.
根据权利要求
26
中任一项所述的方法，其中所述盐是硫氰酸胍鎓
(GSCN)。30.
根据权利要求1‑8和
10
‑
29
中任一项所述的方法，其中所述悬浮液不含醇，例如乙醇
。31.
根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤
(a)
进一步包括向包含沉淀
mRNA
的所述悬浮液中添加至少一种助滤剂
。32.
根据权利要求
31
所述的方法，其中所述沉淀
mRNA
与所述至少一种助滤剂的质量比为约
1:2
；约
1:5
；约
1:10
或约
1:15。33.
根据权利要求
32
所述的方法，其中所述沉淀
mRNA
与所述至少一种助滤剂的质量比为约
1:10。34.
根据权利要求
31
‑
33
中任一项所述的方法，其中所述助滤剂是分散剂
。35.
根据权利要求
34
所述的方法，其中所述分散剂是灰
、
粘土
、
硅藻土
、
玻璃珠
、
塑料珠
、
聚合物
、
聚合物珠
(
例如，聚丙烯珠
、
聚苯乙烯珠
)、
盐
(
例如，纤维素盐
)、
砂和糖中的一种或多种
。36.
根据权利要求
35
所述的方法，其中所述聚合物是天然存在的聚合物，例如纤维素
(
例如，粉状纤维素纤维
)。37.
根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述悬浮液包含至少
100mg、1g、10g、100g、250g、500g、1kg、10kg、100kg、1
公吨或
10
公吨或其之间任何量的
mRNA。38.
根据权利要求
37
所述的方法，其中所述悬浮液包含大于
1kg
的
mRNA。39.
根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤器包括多孔基质
。40.
根据权利要求
39
所述的方法，其中所述多孔基质是滤布
、
滤纸
、
筛网和丝网
。41.
根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤器是微滤膜或超滤膜
。42.
根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤器的平均孔径为约
0.5
微米或更大
、
约
0.75
微米或更大
、
约1微米或更大
、
约2微米或更大
、
约3微米或更大
、
约4微米或更
大或约5微米或更大
。43.
根据权利要求
42
所述的方法，其中所述过滤器的平均孔径为约
0.01
微米至约
200
微米
、
约1微米至约
2000
微米
、
约
0.2
微米至约5微米
、
或约1微米至约3微米，例如约1微米
。44.
根据权利要求
40、42
和
43
中任一项所述的方法，其中所述滤布是平均孔径为约1微米的聚丙烯布
。45.
根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用于洗涤所保留的沉淀
mRNA
的洗涤缓冲剂的体积在约
0.5L/g mRNA
与约
8L/g mRNA
之间
。46.
根据权利要求
45
所述的方法，其中用于洗涤所保留的沉淀
mRNA
的洗涤缓冲剂的体积小于
2L/g mRNA。47.
根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用于洗涤所保留的沉淀
mRNA
的洗涤缓冲剂的体积在约
0.5L/g mRNA
与约
1.5L/g mRNA
之间
。48.
根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用于洗涤所保留的沉淀
mRNA
的洗涤缓冲剂的体积为约
0.5L/g mRNA。49.
根据权利要求
45
‑
48
中任一项所述的方法，其中将所述洗涤缓冲剂以约5升
/min/m2至约
25
升
/min/m2(
相对于所述过滤离心机的过滤器的表面积
)
的速率，例如以约
10
升
/min/m2至约
20
升
/min/m2的速率，例如以约
15
升
/min/m2的速率加载到所述过滤离心机中
。50.
根据权利要求
49
所述的方法，其中在约
0.5
小时至约4小时之间，例如在小于约
90
分钟内，将总体积的洗涤缓冲剂加载到所述过滤离心机中
。51.
根据权利要求
50
所述的方法，其中在约
0.5
小时至约4小时之间，将所保留的沉淀
mRNA
洗涤至在约
50
％至约
100
％之间的纯度
。52.
根据权利要求
51
所述的方法，其中在小于约
90
分钟内，将所保留的沉淀
mRNA
洗涤至至少
95
％，例如约
99
％的纯度
。53.
根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述洗涤缓冲剂包含醇
、
两亲性聚合物
、
缓冲剂
、
盐和
/
或表面活性剂中的一种或多种
。54.
根据权利要求
53
所述的方法，其中所述洗涤缓冲剂包含醇或两亲性聚合物
。55.
根据权利要求
53
或
54
所述的方法，其中所述洗涤缓冲剂包含乙醇，任选地其中所述乙醇为约
80
％重量
/
体积的浓度
。56.
根据权利要求
53
或
54
所述的方法，其中所述洗涤缓冲剂包含选自以下的两亲性聚合物：普朗尼克
、
聚乙烯吡咯烷酮
、
聚乙烯醇
、
聚乙二醇
(PEG)、
三乙二醇单甲醚
(MTEG)
或其组合
。57.
根据权利要求
56
所述的方法，其中所述两亲性聚合物是
PEG。58.
根据权利要求
57
所述的方法，其中所述
PEG
以约
10
％至约
100
％重量
/
体积的浓度存在于所述洗涤溶液中
。59.
根据权利要求
58
所述的方法，其中所述
PEG
以约
50
％至约
95
％重量
/
体积的浓度存在于所述洗涤溶液中
。60.
根据权利要求
59
所述的方法，其中所述
PEG
以约
90
％重量
/
体积的浓度存在于所述洗涤溶液中
。61.
根据权利要求
57
‑
60
中任一项所述的方法，其中所述
PEG
的分子量为约
100
至约
1,000g/mol。
62.
根据权利要求
61
所述的方法，其中所述
PEG
的分子量为约
200
‑
600g/mol。63.
根据权利要求
62
所述的方法，其中所述
PEG
的分子量为约
400g/mol(
例如，
PEG
‑
400)。64.
根据权利要求
56
所述的方法，其中所述两亲性聚合物是
MTEG。65.
根据权利要求
64
所述的方法，其中所述
MTEG
以约
75
％
、
约
80
％
、
约
85
％
、
约
90
％或约
95
％重量
/
体积的浓度存在于所述洗涤溶液中
。66.
根据权利要求
65
所述的方法，其中所述
MTEG
以约
90
％重量
/
体积的浓度或约
95
％重量
/
体积的浓度存在于所述洗涤溶液中
。67.
根据权利要求
66
所述的方法，其中所述
MTEG
以约
95
％重量
/
体积的浓度存在于所述洗涤溶液中
。68.
根据权利要求
53、54
和
56
‑
67
中任一项所述的方法，其中所述洗涤缓冲剂不含醇，例如乙醇
。69.
根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所保留的
mRNA
的回收是在所述过滤离心机运行时发生的
。70.
根据权利要求
69
所述的方法，其中所保留的
mRNA
的回收是经由叶片发生的，所述叶片将所保留的沉淀
mRNA
从所述过滤离心机的过滤器中去除
。71.
根据权利要求1‑
70
中任一项所述的方法，其中所保留的
mRNA
的回收是在所述过滤离心机不运行时发生的
。72.
根据权利要求1‑
6、10
‑
29、31
‑
52
和
56
‑
71
中任一项所述的方法，其中所述方法不含醇，例如乙醇
。73.
根据权利要求3‑
72
中任一项所述的方法，其中所保留的
mRNA
的溶解包括将所述
mRNA
溶解于水性介质中
。74.
根据权利要求
73
所述的方法，其中所述水性介质包括水
、
缓冲剂
(
例如，
Tris
‑
EDTA(TE)
缓冲剂或柠檬酸钠缓冲剂
)、
糖溶液
(
例如，蔗糖或海藻糖溶液
)
或其组合
。75.
根据权利要求
74
所述的方法，其中所述水性介质是注射用水
。76.
根据权利要求
74
所述的方法，其中所述水性介质是
TE
缓冲剂
。77.
根据权利要求
74
所述的方法，其中所述水性介质是
10
％海藻糖溶液
。78.
根据权利要求
73
‑
77
中任一项所述的方法，其中所述溶解发生在所述过滤离心机内
。79.
根据权利要求
73
‑
77
中任一项所述的方法，其中所述溶解发生在所述过滤离心机外
。80.
根据权利要求
31
‑
79
中任一项所述的方法，其中所溶解的
mRNA
的收集包括一个或多个将所述助滤剂与所溶解的
mRNA
分离的步骤
。81.
根据权利要求
80
所述的方法，其中所述一个或多个用于将所述助滤剂与所溶解的
mRNA
分离的步骤包括将包含所溶解的
mRNA
和助滤剂的溶液应用到过滤器上，其中所述助滤剂被所述过滤器保留，从而产生纯化
mRNA
的溶液
。82.
根据权利要求
81
所述的方法，其中通过离心将包含所溶解的
mRNA
和助滤剂的溶液应用到过滤离心机的过滤器上
。83.
根据权利要求
82
所述的方法，其中所述离心机速度施加小于
3100g
，例如在约
...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：翻译生物公司，
类型：发明
国别省市：