通过微生物组的基因治疗来调节微生物群功能以预防、治疗或治愈微生物组相关疾病或障碍制造技术

本发明专利技术包括用于原位修饰细菌(优选天然存在的细菌)的组合物、试剂盒和方法。这些可用于通过以特异性方式调节微生物组的细菌群体所表达和/或分泌的分子来治疗、预防或治愈微生物组相关疾病或障碍。基因组修饰可以以下方式改变这些群体的部分或全部与宿主之间的相互作用，所述方式减少它们对宿主健康的有害潜力。本发明专利技术的组合物、试剂盒和方法不会导致这些群体的直接死亡或对其生长的直接显著抑制。本发明专利技术进一步包括筛选细菌中的基因修饰的方法，确定载体诱导这些基因突变的效率的方法，以及确定这些突变对细菌生长的影响的方法。以及确定这些突变对细菌生长的影响的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过微生物组的基因治疗来调节微生物群功能以预防、治疗或治愈微生物组相关疾病或障碍


[0001]本专利技术涉及用于原位修饰细菌，优选天然存在的细菌的组合物、试剂盒和方法。

技术介绍

[0002]人类微生物群包括生活在我们体内的细菌、古细菌、病毒和微生物真核生物。这些群落的分类组成已被广泛研究，并与各种疾病和性状显著相关。这种微生物群确实由数以千计的不同细菌物种组成，它们携带着数以千亿计的基因，其被称为微生物组。这个微生物组编码对它们的宿主来说必不可少和有益的各种分子(蛋白质、脂质、糖类、RNA等)和功能，例如富集聚糖代谢、氨基酸和异生物，但也调节我们的免疫系统。它还负责合成维生素、类异戊二烯和其他营养物质，这导致人类的整体代谢，其代表了微生物和人类属性的混合。
[0003]测序技术的广泛部署表明，大多数细菌物种不仅在宿主之间具有广泛的遗传变异，而且常常在一个宿主内随着时间的推移而具有广泛的遗传变，甚至在给定的时间在一个宿主内也是如此。
[0004]众多菌株的分离和测序突出了单一细菌物种内的遗传异质性。在单一细菌物种内的不同菌株之间，这种变异包括单核苷酸变体、短的插入和缺失(插入缺失)以及较大的结构变体，其包括重复、缺失、插入、倒置，但也包括水平基因转移，如原噬菌体或质粒的获得以及与这类外源DNA的重组事件。
[0005]由于这种变异，这类菌株在单一宿主中共存时，常常在特定的微生物组生态位中彼此竞争其生存。
[0006]有趣的是，有越来越多的基于宏基因组测序的最近研究表明，特定菌株的存在(以及因此在微生物组中的特定基因特征的存在)可以与多种病理直接相关，所述病理包括自身免疫、感染、炎症、神经退行性疾病或肿瘤发生。
[0007]为了治疗微生物组相关疾病或障碍，目前的方法试图通过使用减法如抗生素、复制性噬菌体、溶素来清除不需要的细菌(以及它们携带的有害基因)，这些方法导致杀死有害细菌，但也杀死非有害细菌。
[0008]虽然这类策略已被证明通过显著减少整个细菌群体的负荷而在短期内是有益的，但其可以：
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诱导强烈的生态失调，并间接导致非目标的有害细菌物种或菌株的短期过度生长。例如，已知诸如艰难梭菌(Clostridium difficile)等细菌可以填补抗生素治疗造成的细菌空白。因此，杀死微生物组内细菌的特定目标物种或菌株可以产生在短期和长期内都可以由有害细菌填补的空白。这些细菌可以与目标物种属于相同或不同的物种。
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在长期导致抗菌素抗性出现，因此在排除携带与病理有关的遗传元件的物种或菌株方面变得低效。例如，抗生素的使用已与金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗生素敏感菌株替换成金黄色葡萄球菌的抗生素抗性菌株有关。因此，获得持久地消除微生物组中的移植细菌群体可具有挑战性，因为微生物组自然处于平衡状态，不同的群体(菌
株或物种)占据着不同的地理和代谢生态位。非特异性治疗如抗生素通常导致几周或几个月后恢复到治疗前存在的平衡。有时，平衡将被扰乱更长的时间，可能发生生态失调。通过噬菌体疗法(野生型噬菌体到工程改造噬菌体、包装的噬菌粒)、溶素、抗微生物肽或任何其他靶向杀灭方法来靶向消除群体，可能同样具有挑战性，因为目标细菌幸存者往往会迅速重新生长以占据留空的生态位。
[0011]获得持久消除微生物组中的细菌群体可具有挑战性，因为微生物组自然处于平衡状态，不同的群体(菌株或物种)占据着不同的地理和代谢生态位。非特异性治疗如抗生素通常导致几周或几个月后恢复到治疗前存在的平衡。有时，平衡将被扰乱更长的时间，可能发生生态失调。通过噬菌体疗法(野生型噬菌体到工程改造噬菌体、包装的噬菌粒)、溶素、抗微生物肽或任何其他靶向杀灭方法来靶向消除群体，可能同样具有挑战性，因为目标细菌幸存者往往会迅速重新生长以占据留空的生态位。
[0012]由于这些原因，原位对目标细菌群体进行基因修饰，无论是在菌株水平还是在物种水平，都可为有吸引力的备选。其可导致有害群体的修饰以移除其有害影响而不杀死目标细菌，并且在某些情况下甚至不影响其适合度，因此不会干扰生态系统的平衡。
[0013]以此方式，就不会产生可被有害细菌填补的空白，也不会导致治疗抗性。这种方法将代表非常强大和优雅的方法来治疗、预防或治愈许多微生物组相关疾病或障碍，特别是在长期或慢性病理的情况下。本专利技术满足了这一需求。

技术实现思路

[0014]本专利技术涉及用于原位修饰天然存在的细菌的方法、试剂盒和组合物。在一个实施方案中，该方法，特别是非治疗性方法，包括原位对天然存在的细菌中的DNA序列进行基因修饰，而不在所述DNA序列中引入双链断裂。优选的是，该基因修饰不会导致细菌死亡。
[0015]在一个实施方案中，该方法，特别是非治疗性方法，包括将所述天然存在的细菌与编码用于诱导基因修饰的酶或系统的载体接触。本专利技术还涉及一种编码用于诱导基因修饰的酶或系统的载体，其用于在原位和/或体内修饰天然存在的细菌的治疗方法。
[0016]在一个实施方案中，所述载体进一步包括条件性复制起点，该起点在目标细菌中无活性，但在供体细菌细胞中具有活性。在一个特定的实施方案中，所述条件性复制起点是以下复制起点，其复制取决于给定蛋白质、肽、核酸、RNA、分子或其任何组合的存在。在一个特定的实施方案中，所述条件性复制起点在所述供体细菌细胞中具有活性，因为所述供体细菌细胞表达所述给定的蛋白质、肽、核酸、RNA、分子或其任何组合。在一个特定的实施方案中，所述条件性复制起点是源自噬菌体可诱导的染色体岛(PICI)的复制起点。在一个特定的实施方案中，所述条件性复制起点在所述供体细菌细胞中具有活性，因为所述供体细菌细胞表达rep蛋白，特别是引发酶
‑
解旋酶。在一个特定的实施方案中，所述条件性复制起点源自大肠杆菌菌株CFT073的PICI的复制起点。在一个特定的实施方案中，所述条件性复制起点包括序列SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8或者由序列SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8组成。
[0017]在一个实施方案中，所述载体不含抗生素抗性标记。
[0018]在一个实施方案中，所述载体位于允许将载体转移到细菌中的递送媒介物内，更特别是细菌病毒颗粒内。在一个实施方案中，该方法包括将所述天然存在的细菌与位于允许将载体转移到细菌中的递送媒介物内的载体接触。优选的是，位于递送媒介物内的载体
是噬菌粒，并且优选的是，递送媒介物是细菌病毒颗粒或衣壳。
[0019]在一个特定的实施方案中，所述载体在细菌病毒颗粒内，更特别是以包装的噬菌粒的形式。在一个实施方案中，该方法包括用包装的噬菌粒转导所述天然存在的细菌。优选的是，噬菌粒包括编码经修饰的核酸酶的核酸序列，该核酸酶经修饰以不能进行DNA双链断裂，同时保留其DNA结合能力，并与执行其他类型的功能的结构域例如执行碱基编辑的结构域融合。优选的是，噬菌粒包括编码核酸酶的核酸序列，该核酸酶为RNA引导核酸酶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种原位修饰天然存在的细菌的方法，其包括：原位对天然存在的细菌中的DNA序列进行基因修饰，而不在所述DNA序列中引入双链断裂，其中所述基因修饰不会导致细菌死亡。2.根据权利要求1所述的方法，其包括将所述天然存在的细菌与载体接触。3.根据权利要求1所述的方法，其包括将所述天然存在的细菌与位于递送媒介物内的载体接触。4.根据权利要求3所述的方法，其中位于递送媒介物内的所述载体是噬菌粒。5.根据权利要求1所述的方法，其包括用包装的噬菌粒转导所述天然存在的细菌。6. 根据权利要求4或5所述的方法，其中所述噬菌粒包括编码dCas9 (死亡
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Cas9)或nCas9 (切口酶Cas9)的核酸序列。7.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述噬菌粒包括编码dCas9和脱氨基酶结构域或者nCas9和脱氨基酶结构域的核酸序列。8.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述噬菌粒包括编码dCas9和逆转录酶结构域或者nCas9和逆转录酶结构域的核酸序列。9.根据权利要求2
‑
8中任一项所述的方法，其中该载体或噬菌粒进一步包括条件性复制起点，该起点在目标天然存在的细菌中无活性，但在供体细菌细胞中具有活性。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述条件性复制起点是复制起点，其复制取决于给定蛋白质、肽、核酸、RNA、分子或其任何组合的存在。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述条件性复制起点在所述供体细菌细胞中具有活性，因为所述供体细菌细胞表达所述给定蛋白质、肽、核酸、RNA、分子或其任何组合。12.根据权利要求9
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11中任一项所述的方法，其中所述条件性复制起点是源自噬菌体可诱导的染色体岛(PICI)的复制起点。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述条件性复制起点在所述供体细菌细胞中具有活性，因为所述供体细菌细胞表达rep蛋白，特别是引发酶
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解旋酶。14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述条件性复制起点源自大肠杆菌菌株CFT073的PICI的复制起点。15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述条件性复制起点包括序列SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8或者由序列SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8组成。16.根据权利要求1
‑
15中任一项所述的方法，其中所述基因修饰是点突变。17.根据权利要求1
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16中任一项所述的方法，其中所述基因修饰是导致基因破坏的点突变。18.根据权利要求1
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17中任一项所述的方法，其中具有该基因修饰的细菌与没有该基因修饰的相同细菌相比，并不具有降低的体内生长率。19.根据权利要求1
‑
18中任一项所述的方法，其中所述基因修饰在细菌毒素基因中。20.根据权利要求19所述的方法，其包括对pks+大肠杆菌中的ClbP基因的基因修饰，所述基因修饰导致大肠杆菌素毒素的单氨基酸突变和遗传毒性活性失活，但保持拮抗活性。21.根据权利要求20所述的方法，其包括在ClbP基因的S95或K98处的基因修饰。22.根据权利要求21所述的方法，其包括S95A、S95R或K98T的基因修饰。
23.根据权利要求1
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18中任一项所述的方法，其中所述基因修饰在粪拟杆菌或多形拟杆菌的β
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半乳糖苷酶基因中。24.根据权利要求16所述的方法，其中具有所述基因修饰的粪拟杆菌或多形拟杆菌β
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半乳糖苷酶蛋白与没有所述基因修饰的粪拟杆菌或多形拟杆菌β
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半乳糖苷酶蛋白相比，显示与人类MYH6心脏肽的同源性较低。25.根据权利要求1
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18中任一项所述的方法，其中所述基因修饰在丙酸丙酸杆菌Ro60直向同源物中。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述基因修饰在至少一个丙酸丙酸杆菌Ro60直向同源物表位中，导致人类免疫系统的较弱或没有识别。27.根据权利要求1
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26中任一项所述的方法，其包括在人类中原位对天然存在的细菌中的至少一个基因进行基因修饰。28.一种通过原位对天然存在的细菌进行基因修饰来调节宿主
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微生物组的相互作用的方法，其中所述天然存在的细菌涉及微生物组相关障碍或疾病，所述方法包括：原位对天然存在的细菌中导致微生物组相关障碍或疾病的DNA序列进行基因修饰，而不在所述DNA序列中引入双链断裂，其中所述基因修饰减少微生物组相关障碍或疾病的影响，以及其中所述基因修饰不会导致细菌死亡。29.根据权利要求28所述的方法，其中具有该基...

【专利技术属性】
技术研发人员：X，
申请(专利权)人：艾力格生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：