一种血浆游离核酸共提取试剂组合、试剂盒及提取方法技术

本发明专利技术公开了一种血浆游离核酸共提取试剂组合、试剂盒及提取方法，属于分子生物学技术领域。所述血浆游离核酸共提取组合第一裂解液、第二裂解液、绑定液和磁珠分散液，进一步还包括平衡液、蛋白清洗液、漂洗液、第一洗脱液和/或第二洗脱液。利用本发明专利技术的试剂组合或试剂盒，结合本发明专利技术的提取方法，能够从血浆样本中提取高质量高纯度的游离核酸，解决游离核酸共提取问题，增加样本的利用率。增加样本的利用率。增加样本的利用率。

【技术实现步骤摘要】
一种血浆游离核酸共提取试剂组合、试剂盒及提取方法


[0001]本专利技术属于分子生物学
，特别地，涉及一种血浆游离核酸共提取试剂组合、试剂盒及提取方法。

技术介绍

[0002]cfDNA(cell Free DNA)又称循环DNA，是指游离于细胞之外的DNA分子，这些DNA分子主要来源于正常细胞某些特定释放过程、细胞凋亡、细胞坏死、以及癌细胞生长浸润过程中的释放，其大小主要集中在160
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170到数百bp，半衰期在数小时左右。
[0003]血液中的cfDNA水平和种类与包括肿瘤在内的多种疾病相关，此外，在母体血液中也能找到胎儿的cfDNA。血液中的cfDNA检测已经被广泛用于各种癌症、某些自身免疫疾病如红斑狼疮的筛查，以及胎儿遗传疾病如唐氏综合征的无创检测。
[0004]游离循环RNA是一种存在于动植物和人的体液中的细胞外游离状态的RNA，有研究报道游离循环RNA
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蛋白质复合体可以作为一种潜在的肿瘤标记物；研究表明宫内发育迟缓、胎儿非整倍体以及子痫前期等妊娠相关疾病与母血中游离RNA有极大关系，说明可以将孕妇血液中游离RNA作为一种新的胎儿遗传信息材料。
[0005]然而，游离核酸在血液中的含量较低且个体差异很大，1mL血浆中游离核酸含量可能为几ng到几十ng不等，如做一次产前筛查仅提取cfDNA就需要10mL左右血液样本，普通试剂盒只能提取游离核酸中的DNA或RNA中的一种，样本不能充分利用。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]本专利技术第一方面提供一种血浆游离核酸共提取试剂组合，包括第一裂解液、第二裂解液、绑定液和磁珠分散液，其中，所述第一裂解液含有2～4％SDS、80～100mM EDTA、50～100mMTris
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HCl，pH为6.0～6.8；SDS使样本中的蛋白变性沉淀，并解聚与核酸结合的核蛋白；EDTA用于抑制样本中可能存在的核酸酶，保护游离核酸；Tris
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HCl用于提供适合酸性PH环境，使RNA溶于水相，DNA溶于有机相。
[0008]所述第二裂解液为水饱和酚，用于变性分离蛋白，并提供有机相。
[0009]所述绑定液含有40～60％异丙醇和1～2MNaCl；其中，异丙醇用于吸收溶液中水分，使核酸析出；NaCl用于提供核酸结合磁珠所需的钠离子。
[0010]所述磁珠分散液中磁珠的浓度为50
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80mg/mL，所述磁珠用于吸附DNA。
[0011]任选地，所述血浆游离核酸共提取试剂组合还包括平衡液，所述平衡液为NaOH溶液，用于调整pH值。优选地，所述NaOH溶液浓度为1％。
[0012]任选地，所述血浆游离核酸共提取试剂组合还包括蛋白清洗液，所述蛋白清洗液含有40～60％盐酸胍和40～60％无水乙醇。其中，盐酸胍用于溶解蛋白；无水乙醇用于清洗蛋白。
[0013]任选地，所述血浆游离核酸共提取试剂组合还包括漂洗液，所述漂洗液包括
0.2MTris
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HCl和60～80％无水乙醇，用于漂洗磁珠。
[0014]任选地，所述血浆游离核酸共提取试剂组合还包括第一洗脱液和第二洗脱液，所述第一洗脱液为无核酸酶水，所述第二洗脱液为5
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10mM Tris
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HCl。优选地，所述Tris
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HCl的pH为8.0。
[0015]本专利技术第二方面提供一种血浆游离核酸共提取试剂盒，包括本专利技术第一方面任一所述的血浆样本cfDNA提取试剂组合。
[0016]特别地，在本专利技术的一个具体实施方案中，所述血浆游离核酸共提取试剂盒包括裂解液、绑定液、磁珠分散液、蛋白清洗液、漂洗液和洗脱液，其中，所述裂解液含有2～4％SDS、50～100mM EDTA、0.5～1MTris
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HCl、1～2MNaCl和10～20％甘油；所述绑定液含有40～60％异丙醇和1～2MNaCl；所述磁珠分散液中磁珠的浓度为50
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80mg/mL；所述蛋白清洗液含有40～60％盐酸胍和40～60％无水乙醇；所述漂洗液包括0.2MTris
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HCl和60～80％无水乙醇，所述洗脱液为5
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10mM Tris
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HCl。
[0017]本专利技术第三方面提供一种血浆游离核酸共提取的方法，利用本专利技术第二方面特别的血浆游离核酸共提取试剂盒进行提取，包括以下步骤：
[0018]S1，在所述血浆样本中加入0.2～0.4倍血浆样本体积的第一裂解液，混匀后加入与所述血浆样本等体积的第二裂解液，50～80℃，≥1000rpm震荡孵育10～20min；
[0019]S2，10000～15000g离心5～15min，吸取水相上清至一新样本管，命名为样本管1，同时下层有机相加入0.2～0.4倍血浆样本体积的第一裂解液，再加入与血浆样本等体积的平衡液，命名为样本管2；
[0020]S3，对样本管1和样本管2分别处理：
[0021]S31，在样本管1中加入1.5～2.5倍血浆样本体积的绑定液，加入0.1～0.2倍上清体积磁珠，充分混匀后室温孵育10min以上，
[0022]S32，样本管2室温剧烈震荡混匀后，室温静置3～10min，10000～15000g离心8～15min，吸取水相上清入一新样本管，命名为样本管3，在样本管3中加入1.5～2.5倍血浆样本体积的绑定液，加入0.1～0.2倍上清体积磁珠，充分混匀后室温孵育10min以上；
[0023]S4，将样本管1和样本管3置于磁力架上，室温静置3～10min，吸弃上清；
[0024]S5，向样本管1和样本管3加入80～150μL的蛋白清洗液，重悬磁珠，室温静置5～15min；
[0025]S6，向样本管1和样本管3加入180～250μL漂洗液，静置10sec以上，吸弃上清并干燥；
[0026]S7，向样本管1中加入20～30μL第一洗脱液，向样本管3中加入20～30μL第二洗脱液，吹打重悬磁珠，室温静置5～15min，将样本管1和样本管3置于磁力架上，室温静置5～15min，吸取上清，得到cfDNA溶液。
[0027]在本专利技术的一些实施方案中，步骤S1中，在所述血浆样本中加入0.25～0.3倍血浆样本体积的裂解液。
[0028]在本专利技术的一些实施方案中，步骤S1中，混匀后70℃金属浴孵育15min。
[0029]本专利技术的有益效果
[0030]相对于现有技术，本专利技术具有以下有益技术效果：
[0031]利用本专利技术的试剂组合或试剂盒，结合本专利技术的提取方法，能够从血浆样本中提
取高质量高纯度的游离核酸，解决游离核酸共提取问题，增加样本的利用率。
附图说明
[0032]图1示出了利用本专利技术的试剂组合提取得到的样本S1的cf本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血浆游离核酸共提取试剂组合，其特征在于，包括第一裂解液、第二裂解液、绑定液和磁珠分散液，其中，所述第一裂解液含有2～4％SDS、80～100mM EDTA、50～100mMTris
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HCl，pH为6.0～6.8；所述第二裂解液为水饱和酚，所述绑定液含有40～60％异丙醇和1～2MNaCl；所述磁珠分散液中磁珠的浓度为50
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80mg/mL。2.根据权利要求1所述的血浆游离核酸共提取试剂组合，其特征在于，还包括平衡液，所述平衡液为NaOH溶液。3.根据权利要求1所述的血浆游离核酸共提取试剂组合，其特征在于，还包括蛋白清洗液，所述蛋白清洗液含有40～60％盐酸胍和40～60％无水乙醇。4.根据权利要求1所述的血浆游离核酸共取试剂组合，其特征在于，还包括漂洗液，所述漂洗液包括0.2MTris
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HCl和60～80％无水乙醇。5.根据权利要求1所述的血浆游离核酸共提取试剂组合，其特征在于，还包括第一洗脱液和第二洗脱液，所述第一洗脱液为无核酸酶水，所述第二洗脱液为5
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10mM Tris
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HCl。6.一种血浆游离核酸共提取试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～5任一所述的血浆游离核酸共提取试剂组合。7.一种血浆游离核酸共提取试剂盒，其特征在于，包括第一裂解液、第二裂解液、平衡液、绑定液、磁珠分散液、蛋白清洗液、漂洗液、第一洗脱液和第二洗脱液，其中，所述第一裂解液含有2～4％SDS、80～100mM EDTA、50～100mMTris
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HCl，pH为6.0～6.8；所述第二裂解液为水饱和酚；所述平衡液为NaOH溶液；所述绑定液含有40～60％异丙醇和1～2MNaCl；所述磁珠分散液中磁珠的浓度为50
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80mg/mL；所述蛋白清洗液含有40～60％盐酸胍和40～60％无水乙醇；所述漂洗液包括0.2MTris
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H...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁洪，郎秋蕾，李璐璐，
申请(专利权)人：杭州联川生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：