去除血浆中宿主核酸的方法、试剂盒及应用技术

本发明专利技术涉及到mNGS检测领域，特别是涉及到一种去除血浆中宿主核酸的方法、试剂盒及应用，方法，将磁珠与组蛋白单克隆抗体偶联，制成捕获磁珠，将所述捕获磁珠与血浆进行孵育，将核小体上的组蛋白捕获，去除宿主核酸。本发明专利技术利用组蛋白的抗体去捕获核小体，去除宿主的核小体cfDNA复合物，以达到血浆样本去宿主的目的，提高病原体微生物宏基因组的检测灵敏度，特别适用于血浆样本等病原微生物宏基因组检测。测。测。

【技术实现步骤摘要】
去除血浆中宿主核酸的方法、试剂盒及应用


[0001]本专利技术涉及到mNGS检测领域，特别是涉及到一种去除血浆中宿主核酸的方法、试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]近年来，造成人类感染的病原微生物日益复杂，种类增多，抗菌药物的滥用致使细菌耐药，病原微生物已成为全球关注的焦点。据WHO统计，在中国，感染性疾病占所有疾病的50%以上，面对重症感染患者，能否快速确认感染病原体，成为后续对症治疗的关键，基于宏基因组新一代测序技术（metagenomics nextgeneration sequencing, mNGS）为解决这一问题提供了一个可能的突破方向。随着基因测序技术的迅猛发展，基于二代测序的mNGS成为了临床的焦点。不依赖于传统的微生物培养，直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，然后与数据库进行比对分析，根据比对到的序列信息来判断样本包含的病原微生物种类，能够快速、客观的检测临床样本中的较多病原微生物（包括病毒、细菌、真菌、寄生虫），且无需特异性扩增，尤其适用于急危重症和疑难感染的诊断。
[0003]病原微生物的检出对于患者来说至关重要，然而，大多数的临床样本，比如血浆、肺泡灌洗液、脑脊液等等被广泛应用于宏基组病原微生物检测，此类样本中含有大量人细胞，并且人细胞基因组过高，导致宏基组测序得到测序数据的90％以上的序列为人源序列，从而大大影响宏基因组病原微生物检出的灵敏度，如何高效地去宿主化提取是临床病原微生物宏基因组测序的关键。
[0004]目前常见的去宿主DNA的方法比如过滤法，将样本通过微滤膜进行过滤，取过滤后样本进行宏基组测序；还有酶解法，将样本直接用酶去除暴露的DNA，仅留下完整的微生物细胞用于下游分析。
[0005]血浆样本也是宏基因组技术应用的一种主要的样本类型，通过对血浆样本的游离DNA提取、建库、测序和分析，可以识别存在于血浆中的病原游离DNA（cfDNA），从而帮助如脓毒血症等患者的早期诊断。在宏基因组检测中，血浆样本同样受到了高宿主cfDNA对于检测灵敏度的影响，在炎症较强的患者中，我们发现其人源DNA的浓度与正常健康人相比存在显著的差异，这种高人源更加妨碍了宏基因组的检出能力，因此，血浆样本的去宿主技术是具有很大的价值的。
[0006]但是不同于肺泡灌洗液和脑脊液，血浆中的人源序列大都是由游离DNA组成的，无法通过传统的去宿主方法进行人源DNA的去除。现在关于血浆怎么去宿主核酸，目前尚未有报道存在合适的方法。所以目前对于血浆样本去除人源DNA的
亟需一种高效、快速且微生物覆盖全面的，可实现的去宿主方法。有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种去除血浆中宿主核酸的方法，利用组蛋白的抗体去捕获核小体，去除宿主的核小体cfDNA复合物，以达到血浆样本去宿主的目的，提高病原体微
生物宏基因组的检测灵敏度，特别适用于血浆样本等病原微生物宏基因组检测。
[0008]本专利技术采用如下的技术方案：一种去除血浆中宿主核酸的方法，将磁珠与组蛋白单克隆抗体偶联，制成捕获磁珠，将所述捕获磁珠与血浆进行孵育，将核小体上的组蛋白捕获，去除宿主核酸。
[0009]在真核细胞的细胞核中，DNA被8个组蛋白包裹，形成染色质的基本重复单位，称为核小体。在血浆中，游离DNA并非裸露存在，而是和核小体形成较为紧密的一个蛋白
‑
核酸复合体（图1）。
[0010]而病原游离DNA在血浆中的构成，还没有明确的报道，有可能是和一些Hu蛋白结合形成复合物。但无论是怎样的结果，血浆的游离DNA
‑
核小体的复合物是一个很明确的存在形式，我们利用对于游离DNA
‑
核小体的复合物的捕获去除，可以实现血浆样本的宿主游离DNA的降低。
[0011]本专利技术中，利用针对组蛋白的抗体去捕获核小体，去除宿主的核小体cfDNA复合物，以达到血浆样本去宿主的目的，提高病原体微生物宏基因组的检测灵敏度。该方法对宿主核酸去除彻底，且快速、简便。
[0012]具体的步骤如下：S
‑
1.取组蛋白单克隆抗体，加入磁珠和偶联缓冲液，孵育过夜；S
‑
2.使用封闭缓冲液进行封闭，封闭完成后，用洗涤缓冲液洗涤，得到捕获磁珠；S
‑
3.向血浆中加入捕获磁珠，孵育，得到上清液，即为去除宿主核酸的血浆样本。
[0013]作为优选，所述的组蛋白单克隆抗体为H3抗体。
[0014]作为优选，所述偶联缓冲液为0.1
‑
0.2M硼酸缓冲液，pH9.0
‑
9.5。
[0015]作为优选，所述封闭缓冲液和所述洗涤缓冲液均为含有Tween 20和BSA的PBS溶液。
[0016]作为优选，所述封闭缓冲液和所述洗涤缓冲液中，Tween 20的含量是0.1
‑
0.2M， BSA的含量为1%
‑
2%，pH值为7.0
‑
8.0。
[0017]作为优选，步骤S
‑
1中的孵育温度为30
‑
37℃。
[0018]作为优选， 步骤S
‑
2中使用封闭缓冲液进行封闭的封闭温度为30
‑
37℃，封闭时间为1
‑
2h。
[0019]作为优选，步骤S
‑
3中孵育条件为室温、1
‑
2h。
[0020]作为优选，所述血浆为人源或动物源血浆。
[0021]上述的去除宿主核酸的方法，利用抗体蛋白的特异性结合，可以高效去除血浆中宿主cfDNA，而且处理简单。
[0022]本专利技术还提供一种去除宿主核酸的试剂盒，包含有组蛋白单克隆抗体、磁珠、偶联缓冲液、封闭缓冲液以及洗涤缓冲液。
[0023]其中，作为优选，所述的组蛋白单克隆抗体为H3抗体。
[0024]作为优选，所述偶联缓冲液为0.1
‑
0.2M硼酸缓冲液，pH9.0
‑
9.5。
[0025]作为优选，所述封闭缓冲液和所述洗涤缓冲液均为含有Tween20和BSA的PBS溶液。
[0026]作为优选，所述封闭缓冲液和所述洗涤缓冲液中，Tween 20的含量是0.1
‑
0.2M，BSA的含量为1%
‑
2%，pH值为7.0
‑
8.0。
[0027]本专利技术还提供一种对血液样本中微生物进行检测的方法，其包含采用上述方法去
除宿主核酸的步骤。在对微生物进行检测之前，高效去除宿主核酸，避免宿主核酸对检测结果的影响，提高病原体微生物宏基因组的检测灵敏度。
附图说明
[0028]附图1为蛋白
‑
核酸复合体的结构示意图；附图2为对血液样本中微生物进行检测的流程示意图。
具体实施方式
[0029]下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种去除血浆中宿主核酸的方法，其特征在于，将磁珠与组蛋白单克隆抗体偶联，制成捕获磁珠，将所述捕获磁珠与血浆进行孵育，将核小体上的组蛋白捕获，去除宿主核酸。2.根据权利要求1所述的一种去除血浆中宿主核酸的方法，其特征在于，所述的组蛋白单克隆抗体为H3抗体。3.根据权利要求1所述的一种去除血浆中宿主核酸的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：S
‑
1.取组蛋白单克隆抗体，加入磁珠和偶联缓冲液，孵育过夜；S
‑
2.使用封闭缓冲液进行封闭，封闭完成后，用洗涤缓冲液洗涤，得到捕获磁珠；S
‑
3.向血浆中加入捕获磁珠，孵育，得到上清液，即为去除宿主核酸的血浆样本。4.根据权利要求3所述的一种去除血浆中宿主核酸的方法，其特征在于，所述偶联缓冲液为0.1
‑
0.2M硼酸缓冲液，pH9.0
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9.5。5.根据权利要求3所述的一种去除血浆中宿主核酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚婧雯，韩序，王计超，李重阳，
申请(专利权)人：杭州杰毅生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：