一种四氢嘧啶偶联磁珠提取核酸的方法技术

本发明专利技术提供了一种四氢嘧啶偶联磁珠提取核酸的方法，含有四氢嘧啶偶联磁珠、裂解液：4～6mol/L的异硫氰酸胍、0.01

【技术实现步骤摘要】
一种四氢嘧啶偶联磁珠提取核酸的方法


[0001]本专利技术属于分子生物检测
，涉及核酸提取，具体来说是一种四氢嘧啶偶联磁珠提取试剂盒。
技术背景
[0002]磁珠法依据与吸附膜相似的原理，将带有固化亲和配基的磁载体或者与靶核酸有亲和力的预制生物聚合物用于分离步骤。同时利用磁珠自身的磁性，在外磁场的作用下可以方便的实现定向移动与富集，从而达到核酸与杂质分离的目的，进而实现对目标物质的分离纯化，获得纯化核酸。磁珠法提取核酸的重中之重就在于磁珠和核酸的吸附能力，它直接影响了抽提核酸的产量。现在生产的磁珠主要为两种：离子键结合磁珠(主要为硅羟基磁珠)和共价键结合磁珠(纤维素膜磁珠)。前者在市面上多见，生产厂家多。对此，我们将使用一种新的包被物质，已提高磁珠吸附的作用。
[0003]四氢嘧啶是一种氨基酸的衍生物，也是嘧啶相似物。研究表明，四氢嘧啶能与DNA 发生直接结合。四氢嘧啶之所以能够与DNA结合的原因主要为：1)与核酸碱基的直接相互作用，可能是由于阳离子
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π
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相互作用。2)与带负电荷的磷酸骨架直接相互作用，当羧基与氨基磁珠偶联后，四氢嘧啶的另外一端带有正电荷，把核酸视为阴离子团，四氢嘧啶与核酸在静电力的作用下能够互相吸附。3)与带正电荷的抗衡离子的相互作用。4)通过改变溶剂性质进行间接相互作用。5)四氢嘧啶的化学结构与嘧啶类碱基类似，能够通过氢键的形式对核酸进行吸附，特别是嘌呤含量高的核酸分子。四氢嘧啶能与嘌呤直接结合(四氢嘧啶为嘧啶相似物)。所以，种种条件都说明了四氢嘧啶或者其衍生物能够强有力的吸附核酸。而且四氢嘧啶是一种相容性有机小分子化合物，是通过生物合成的，仅仅对于双链不稳定，而对于单链有着稳定作用(可能竞争碱基间相互作用)。许多研究还报道了四氢嘧啶生物相容性好，对人体无毒无害，对DNA也无损伤作用。综上所述，四氢嘧啶可能成为一种包被磁珠用于提取DNA，或者提高磁珠提取效率表面包被物质。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的上述技术问题，本专利技术提供了用四氢嘧啶包被于磁珠表面对核酸进行分离提纯，以达到快速、安全、高效地提取核酸的目的；弥补现在国产磁珠对标本中核酸吸附力低下等问题。
[0005]本专利技术提供了一种四氢嘧啶与磁珠偶联的方法,包括试剂与配方：1)取5mmol的四氢嘧啶(约0.7108g)，溶解在2mL PBS(PH＝7.4)溶液中为A；2) 将5mmol的1
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(3
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二甲氨基丙基)
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乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，约0.9556g)与5mmol N
‑ꢀ
羟基丁二酰亚胺(NHS，约0.5754g)混合于2mL PBS(7.4)溶液中为B；3)将A与B 两种溶液混合并摇晃反应30min使四氢嘧啶羧基活化；4)将氨基磁珠用PBS洗涤三次后加入活化的四氢嘧啶并颠倒摇晃反应1h；5)再次用PBS洗涤三次，用四氢嘧啶磁珠保存液4℃保存。
[0006]一种四氢嘧啶偶联磁珠的保存液：无水乙醇溶液。
[0007]一个针对该磁珠提取核酸的试剂：裂解液：4～6mol/L的异硫氰酸胍、0.01
ꢀ‑
0.015 mol/L的Tris
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Cl、0.1
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0.2mol/L的NaCl溶液、0.9％
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1.5％的曲通X
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100，四种液体比例为 1:1:1:1；结合液：四氢嘧啶偶联磁珠溶液，磁珠平均粒径为2μm，结合液中含有乙醇或 PBS；蛋白酶K:浓度为50mg/mL；洗涤液Ⅰ：0.25
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0.45mol/L的NaCl溶液、pH8.0
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9.0 的Tris
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HCl；洗涤液Ⅱ为75％的乙醇；洗脱液：浓度为0.5
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1mg/L四氢嘧啶溶液。
[0008]本专利技术的核酸提取主要包括以下几步骤：1)裂解：取离心管，加入的蛋白酶K，血清以及其他标本，裂解液(根据提取目标核酸是否为游离而定)，漩涡震荡混合后37℃水浴10min；2)结合：加入还有四氢嘧啶偶联磁珠的结合液，旋涡震荡并静置5min磁性分离，弃去上清；3)洗涤：加入洗涤液Ⅰ震荡并磁性分离，弃去上清再用洗涤液Ⅱ洗涤弃去上清(尽量吸走上清液)；4)洗脱：加入洗脱液旋涡震荡充分重悬，50℃加热5min 磁性分离并将上清液转移至新的离心管进行PCR或保存。
[0009]本专利技术的试剂盒采用细胞裂解、磁珠吸附核酸、蛋白质变性以及去除、高盐溶液增强四氢嘧啶与核酸之间的吸附性、将核酸洗脱分离步骤；所采用试剂安全无毒、核酸提取高效；既可以手工操作也可以用于自动化平台，利用本专利技术的试剂盒可以安全快速高效的获得高质量的病毒核酸。适合于科研人员、临床检验等做分子检测人员快速、有效、经济地提取核酸。
[0010]本专利技术与其他技术相比，采用新的、独特的磁珠对核酸进行吸附，其新颖性与创新性显而易见，且在具体实施案例中验证了该磁珠能够很好地进行核酸的提取。
[0011]本专利技术洗脱液中含有四氢嘧啶，该洗脱液在PCR时能够降低DNA溶解温度(TM 值)，利于PCR更好地进行。
附图说明
图1为HBV血清标本分别用某进口磁珠(第1道)、四氢嘧啶偶联磁珠(2、3道)、氨基裸磁珠(第4道)进行提取并扩增后琼脂糖核酸电泳结果图。图2为HBV标本进行等比稀释后四氢嘧啶磁珠试剂盒提取并扩增后琼脂糖核酸电泳结果图。备注：阴性对照是用300血清不提取直接进行PCR以及电泳具体实施
[0012]下面详细描述本专利技术的实施案例，所述实施案例的示例在附图中示出。通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。具体实施例1：血浆中HBV病毒核酸的提取以及检测(与国内某厂家进口磁珠比较)。
[0013](1)提取病毒核酸。
[0014]1)临床收集HBV核酸阳性患者血清(血清标本来自南华大学附属第一医院检验科)
[0015]2)在2mL离心管中加入30μL的蛋白酶K，300μL血清标本，200μL裂解液，，漩涡震荡
混合后37℃水浴10min。
[0015]3)加入含有四氢嘧啶偶联磁珠的结合液40μL，旋涡震荡并静置5min磁性分离，弃去上清。
[0016]4)加入洗涤液Ⅰ1mL震荡并磁性分离，弃去上清再用800μL洗涤液Ⅱ洗涤弃去上清(尽量吸走上清液)
[0018]5)加入洗脱液旋涡震荡充分重悬，50℃加热5min磁性分离并将上清液转移至新的离心管。
[0019](2)病毒基因扩增
[0020]PCR体系：PCR体系：
[0021]PCR反应程序：附：程序2至程序4进行反复循环，循环次数为34次
[0022]HBV引物：HBV PrimerF:TCGTGTTACAGGCGGGGTTTHBV PrimerR:GGCACTAGTAAACTGAGCCA
[0023](3)琼脂糖本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种四氢嘧啶偶联磁珠提取核酸的方法，其特征是：四氢嘧啶类化合物与磁珠相结合，通过四氢嘧啶类化合物对核酸的吸附作用来来达到核酸提取的目的。2.根据权利要求1所述的四氢嘧啶偶联磁珠提取核酸的方法，其特征是：四氢嘧啶类化合物包含四氢嘧啶(1,2
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二甲基
‑
1,4,5,6
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四氢嘧啶)以及四氢嘧啶衍生物。3.根据权利要求1或2所述的四氢嘧啶偶联磁珠提取核酸的方法，其特征是：所述磁珠为氨基磁珠，四氢嘧啶类化合物含有羧基，通过羧基与氨基磁珠形成酰胺键偶联。4.根据权利要求1或2所述的四氢嘧啶偶联磁珠提取核酸的方法，其特征是：磁珠偶联步骤为：1)取5mmol的四氢嘧啶(约0.7108g)，溶解在2mL PBS(PH＝7.4)溶液中为A；2)将5mmol的1
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二甲氨基丙基)
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乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，约0.9556g)与5mmol N
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羟基丁二酰亚胺(NHS，约0.5754g)混合于2mL PBS(7.4)溶液中为B；3)将A与B两种溶液混合并摇晃反应30min使四氢嘧啶羧基活化；4)将氨基磁珠用PBS洗涤三次后加入活化的四氢嘧啶并颠倒摇晃反应1h；5)再次用PBS洗涤三次，用四氢嘧啶磁珠保存液4℃保存。5.根据权利要求3所述的四氢嘧啶偶联磁珠提取核酸的方法，其特征是：磁珠偶联步骤为：1)取5mmol的四氢嘧啶(约0.7108g)，溶解在2mL PBS(PH＝7.4)溶液中为A；2)将5mmol的1
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二甲氨基丙基)
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乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，约0.9556g)与5mmol N
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羟基丁二酰亚胺(NHS，约0.5754g)混合于2mL PBS(7.4)溶液中为B；3)将A与B两种溶液混合并摇晃反应30min使四氢嘧啶羧基活化；4)...

【专利技术属性】
技术研发人员：左建宏，黄佳璐，丁禹博，
申请(专利权)人：南华大学，
类型：发明
国别省市：