用于提取核酸的细胞裂解液及其应用制造技术

本发明专利技术涉及用于提取核酸的细胞裂解液及其应用。本发明专利技术的细胞裂解液包括：5

【技术实现步骤摘要】
用于提取核酸的细胞裂解液及其应用


[0001]本专利技术涉及一种用于提取核酸的细胞裂解液及其应用。

技术介绍

[0002]基因编辑后获得的细胞需要快速抽提DNA用于基因型鉴定以确定基因打靶成功的细胞株。获取DNA的传统方法是以新鲜、
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70℃或液氮保存的标本为材料，通过蛋白酶K消化，酚、氯仿抽提，结合离心柱法或磁珠法进行核酸提取。1987年，Fey等首先用NP40成功地从骨髓涂片中提取到较高分子量的DNA，用于Southern印迹分析，但这种方法均需蛋白酶K消化，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀等步骤，操作复杂，费时且需要的样品量较多。同时，需要在多个离心管之间转移，易造成核酸的损失及标本间的交叉污染。由于PCR技术对DNA样品的纯度和分子量的要求相对较低，对微量的DNA即可扩增，部分降解的DNA也可作PCR检测。因此，用NP40和蛋白酶K消化的粗提产物也可用于PCR。后来人们发现用HOTSHOT DNA消化法用于小鼠尾巴或耳样的DNA抽提可以更简洁有效的进行PCR鉴定。近年来，Chelex
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100被广泛用于检材较少或只需少量DNA的检测。Chelex
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100是一种化学整合树脂，有苯乙烯，二乙烯苯共聚体组成，含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，可螯合二价金属离子，抑制DNA酶而达到减少DNA降解的目的。Chelex
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100结合蛋白酶K消化法被广泛用于法医学，肿瘤学鉴定及分子生物学实验。对基因编辑胚胎干细胞进行鉴定有时只能获得数10个细胞用于鉴定，而且蛋白酶K消化要花费较长的时间，需要更快更灵敏的从基因编辑胚胎干细胞进行DNA抽提。

技术实现思路

[0003]为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本专利技术开发了Chelex
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100与HOTSHOT结合的核酸提取法，提供了一种细胞裂解液，以及基于该裂解液的核酸提取方法和采用基于该裂解液的细胞裂解物直接进行PCR的方法。本专利技术提供的细胞裂解液中，通过化学原理可迅速破坏细胞膜结构，达到裂解细胞释放核酸的目的，同时通过抑制DNA酶活性，减少DNA降解，而减少中转管的使用，避免液体在离心管间移动和移液器吸头移液导致的微量核酸损失，进一步提高核酸提取效率。
[0004]为此，在第一方面，本专利技术一种用于提取核酸的细胞裂解液，包括：
[0005][0006]在一些实施方式中，所述细胞裂解液中，NaOH的浓度可以为5mM、7.5mM、10mM、12.5mM、15mM、17.5mM、20mM或它们之间的任意值。
[0007]在一些实施方式中，所述细胞裂解液中，Chelex
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100的浓度为1％(w/v)、2％(w/v)、3％(w/v)、4％(w/v)、5％(w/v)、6％(w/v)、7％(w/v)、8％(w/v)、9％(w/v)、10％(w/v)或
它们之间的任意值。
[0008]在一些实施方式中，所述细胞裂解液中，NP40的浓度为0.05％(v/v)、0.1％(v/v)、0.15％(v/v)、0.2％(v/v)、0.25％(v/v)、0.3％(v/v)、0.35％(v/v)、0.4％(v/v)、0.45％(v/v)、0.5％(v/v)或它们之间的任意值。
[0009]在一些实施方式中，所述细胞裂解液中，EDTA的浓度为0.05mM、0.1mM、0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mM或它们之间的任意值。
[0010]在一些实施方式中，所述细胞裂解液包括：
[0011][0012]在一些实施方式中，包括10mM NaOH、5％(w/v)Chelex
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100、0.1％(v/v)NP40和0.1mM EDTA。
[0013]在一些实施方式中，所述细胞裂解液中不包括Triton X
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100。专利技术人发现，本专利技术的细胞裂解液中不包括Triton X
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100，可以显著提高细胞鉴定的效率。推测是由于Triton X
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100和NP
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40共同使用会降低DNA二级结构，增加模板基因的扩增，Triton X
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100和NP
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40的双重使用会显著增加非特异性扩增，进而影响对细胞的鉴定。
[0014]在第二方面，本专利技术提供了一种提取核酸的方法，包括将细胞与第一方面所述的细胞裂解液混合的步骤。
[0015]在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：
[0016]将培养在96孔板中的细胞与所述细胞裂解液混合，并进行孵育；
[0017]将含细胞裂解液的96孔板进行离心，去除沉淀物。
[0018]在一些实施方式中，所述方法还包括在PCR反应前获得的提取液保存在4℃并再次离心。
[0019]在一些实施方式中，所述细胞裂解液的加入量为15
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25μL。在一些实施方式中，所述细胞裂解液的加入量可以为15μL、16μL、17μL、18μL、19μL、20μL、21μL、22μL、23μL、24μL、25μL以及它们之间的任意值。
[0020]在一些实施方式中，所述孵育的温度为92
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98℃，时间为15
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40分钟。在一些实施方式中，所述孵育的温度为92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃或它们之间的任意值。在一些实施方式中，所述孵育的时间为15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟或它们之间的任意值。
[0021]在一些实施方式中，所述离心的速度为13000
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16000r/min，例如为13000r/min、14000r/min、15000r/min、16000r/min或它们之间的任意值。
[0022]在一些实施方式中，所述离心的时间为2
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3分钟。
[0023]在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：
[0024](1)将培养的细胞在96孔板中与所述细胞裂解液混合；
[0025](2)将步骤(1)得到的混合液进行孵育，使得细胞破裂以及蛋白质变性；
[0026](3)将步骤(2)得到的孵育后的96孔板进行离心，去除沉淀物；
[0027](4)在PCR反应前将步骤(3)获得的提取液保存在4℃并再次离心。
[0028]本专利技术的核酸提取方法中，将培养在96孔板中的细胞去掉培养液后，直接加入裂解液进行混合孵育。本专利技术将HOTSHOT核酸提取法结合Chelex
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100，所得核酸粗提物可以直接进行PCR，与现有的PCR方法相比，绕开了DNA提纯步骤，省时省力，能够简单、快速、高效处理微量的各种动物细胞以直接进行PCR扩增鉴定；该方法特别适用于微量基因编辑动物细胞高通量细胞鉴定。
[0029]本专利技术还提供了一种PCR方法，其采用根据本专利技术第本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于提取核酸的细胞裂解液，包括：2.根据权利要求1所述的细胞裂解液，其特征在于，所述细胞裂解液包括：3.根据权利要求1或2所述的细胞裂解液，其特征在于，所述细胞裂解液包括10mM NaOH、5％(w/v)Chelex
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100、0.1％(v/v)NP40和0.1mM EDTA。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的细胞裂解液，其特征在于，所述细胞裂解液中不包括Triton X
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100。5.一种提取核酸的方法，包括将细胞与权利要求1
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4中任一项所述的细胞裂解液混合的步骤。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将培养在96孔板中的细胞与所述细胞裂解液混合，并进行孵育；将含细胞裂解液的96孔板进行离心，去除沉淀物。7.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨月萍，
申请(专利权)人：广州明迅生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：