雌性胚胎干细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及雌性胚胎干细胞及其制备方法和应用。本发明专利技术通过筛选获得的雌性胚胎干细胞提高了雌性小鼠的出生率。提高了雌性小鼠的出生率。

【技术实现步骤摘要】
雌性胚胎干细胞及其制备方法和应用


[0001]本专利技术生物
，具体地，本专利技术涉及雌性胚胎干细胞及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]四倍体是指细胞中含有的染色体是最小染色体组数的四倍，即细胞中具有四个完整的染色体组的生物个体或者细胞。
[0003]四倍体补偿技术是将四倍体(4n)胚胎与二倍体(2n)胚胎或胚胎干细胞 (Embryonic stem cell，ESC，也可称为ES或EK细胞)聚合，形成嵌合体。在发育过程中4n细胞主要参与胚外组织(如滋养层、卵黄囊膜、尿囊膜和胎盘等) 形成而几乎不参与胚体的形成，从而可以得到几乎完全2n胚胎或ES细胞来源的动物个体，例如小鼠。
[0004]在实际应用中，雌性胚胎干细胞发育成个体，比雄性胚胎干细胞发育成个体的概率小很多。原因之一是由于雌性ES细胞比雄性ES细胞更容易分化，导致培养雌性ES细胞难度更大。现有研究表明四倍体补偿雌性ES动物的出生率非常低，不足1％，甚至不能繁殖出雌性ES动物。因此，需要提高嵌合体胚胎雌性 ES动物的出生率。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种雌性胚胎干细胞及其制备方法和应用，解决由胚胎干细胞繁殖雌性小鼠，雌性小鼠出生率低的技术问题。
[0006]第一方面，本公开提供一种雌性胚胎干细胞，所述雌性胚胎干细胞于2022 年6月28日保藏广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC，地址：广州市先烈中路 100号大院59号楼5楼)，保藏编号为GDMCCNo.62563。
[0007]第二方面，本公开提供一种本专利技术第一方面提供的雌性胚胎干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
[0008]将多个小鼠的囊胚分别置于滋养层细胞上，并于胚胎干细胞培养基中培养；
[0009]待所述囊胚发育成内细胞团，将所述内细胞团分散，终止培养，得到多个胚胎干细胞；
[0010]从所述多个胚胎干细胞中筛选出所述雌性胚胎干细胞。
[0011]由于本公开的雌性胚胎干细胞是通过筛选小鼠的胚胎干细胞获得的。因此，需要对多个小鼠的囊胚，通常十几个小鼠的囊胚，例如12个、13个、14个、15个、 16个、17个、18个、19个或更多，甚至几十个或上百个小鼠的囊胚进行筛选。幸运的是，本公开在筛选了12个小鼠的胚胎干细胞，并通过高效四倍体补偿技术，即获得了约为30％的雌性小鼠出生率。
[0012]在一些实施方式中，所述小鼠为C57品系小鼠。
[0013]在一些实施方式中，所述小鼠为C57BL/6小鼠。
[0014]在一些实施方式中，所述从所述多个胚胎干细胞中筛选出所述雌性胚胎干细胞包括以下步骤：
[0015]将所述多个胚胎干细胞分别与四倍体胚胎细胞聚合，形成多个嵌合体胚胎；
[0016]将所述多个嵌合体胚胎分别移植到雌鼠的子宫内，发育成小鼠，计算雌性小鼠出生率；
[0017]选择雌鼠出生率在预设值以上的胚胎干细胞作为所述雌性胚胎干细胞。
[0018]本领域技术人员可以根据自己的经验来确定雌鼠出生率的预设值。在一些实施方式中，所述预设值可以为28％，优选可以为30％。
[0019]在一些实施方式中，所述雌性胚胎干细胞与四倍体胚胎细胞为同种异体或异种异体。
[0020]第三方面，本公开提供一种制备嵌合体胚胎的方法，所述方法包括：将本公开第一方面提供的雌性胚胎干细胞与四倍体胚胎细胞聚合，形成所述嵌合体胚胎。
[0021]在一些实施方式中，所述方法还包括：将小鼠的胚胎细胞置于电融合液中，进行电融合，获得四倍体胚胎细胞的步骤。
[0022]在一些实施方式中，所述胚胎细胞为2
‑
细胞胚胎细胞。
[0023]在一些实施方式中，所述小鼠选自C57BL/6小鼠、B6C3F1小鼠和CD
‑
1小鼠。
[0024]在一些实施方式中，所述方法包括以下步骤：
[0025]将小鼠的胚胎细胞置于电融合液中，进行电融合，获得四倍体胚胎细胞；
[0026]将所述四倍体胚胎细胞置于培养基中进行培养；
[0027]将本公开第一方面提供的雌性胚胎干细胞与培养后的四倍体胚胎细胞聚合，形成所述嵌合体胚胎。
[0028]在一些实施方式中，所述培养基选自KSOM培养基。
[0029]在一些实施方式中，所述电融合液包括：甘露醇、MgSO4、CaCl2和牛血清白蛋白；所述甘露醇、所述MgSO4、所述CaCl2和所述牛血清白蛋白的质量比为 (9～53):(0.015～0.241):(0.013～0.23):(0.01～5)。
[0030]在一些实施方式中，所述甘露醇、所述MgSO4、所述CaCl2和所述牛血清白蛋白的质量比为(18～52):(0.018～0.241):(0.016～0.23):(0.01～4)。
[0031]在一些实施方式中，所述甘露醇、所述MgSO4、所述CaCl2和所述牛血清白蛋白的质量比为(27～52):(0.018～0.12):(0.016～0.1):(1～3.5)。
[0032]在一些实施方式中，所述电融合液包含以下组分：
[0033][0034]在一些实施方式中，所述电融合液包含以下组分：
[0035][0036]在一些实施方式中，所述电融合液包含以下组分：
[0037][0038][0039]在一些实施方式中，所述电融合液包含以下组分：
[0040][0041]在一些实施方式中，所述电融合液包含以下组分：
[0042][0043]在一些实施方式中，所述方法还包括：将所述四倍体胚胎细胞置于培养基中进行培养的步骤，之后将本公开第一方面提供的雌性胚胎干细胞与培养后的四倍体胚胎细胞聚合。
[0044]第四方面，本公开提供本公开第一方面提供的雌性胚胎干细胞在制备嵌合胚胎中的应用，所述嵌合胚胎包括所述雌性胚胎干细胞和四倍体胚胎细胞。
[0045]在一些实施方式中，所述四倍体胚胎细胞是将小鼠的胚胎细胞置于电融合液中，进行电融合，获得的四倍体胚胎细胞。
[0046]在一些实施方式中，所述胚胎细胞为2
‑
细胞胚胎细胞。
[0047]第五方面，本公开提供本公开第一方面提供的雌性胚胎干细胞在产生小鼠中的应用。
[0048]本专利技术通过筛选获得的雌性胚胎干细胞具有高效四倍体补偿技术获得的雌性小鼠出生率。
[0049]利用四倍体补偿技术，将本专利技术提供的雌性胚胎干细胞与四倍体胚胎细胞聚合获得的嵌合体胚胎，使得雌性小鼠的出生率提高到约为30％。
[0050]利用由2
‑
细胞胚胎融合获得的四倍体胚胎细胞，提高了四倍体补偿技术生产小鼠的稳定性。
附图说明
[0051]图1显示了小鼠胚胎干细胞的电镜照片。
[0052]图2显示了由12株小鼠胚胎干细胞繁殖的后代小鼠的出生率。
[0053]图3显示了第8株小鼠胚胎干细胞的核型鉴定结果。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种雌性胚胎干细胞，其特征在于，所述雌性胚胎干细胞于2022年6月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.62563。2.一种制备权利要求1所述的雌性胚胎干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将多个小鼠的囊胚分别置于滋养层细胞上，并于胚胎干细胞培养基中培养；待所述囊胚发育成内细胞团，将所述内细胞团分散，终止培养，得到多个胚胎干细胞；从所述多个胚胎干细胞中筛选出所述雌性胚胎干细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述小鼠为C57品系小鼠，优选为C57BL/6小鼠。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述从所述多个胚胎干细胞中筛选出所述雌性胚胎干细胞包括以下步骤：将所述多个胚胎干细胞分别与四倍体胚胎细胞聚合，形成多个嵌合体胚胎；将所述多个嵌合体胚胎分别移植到雌鼠的子宫内，发育成小鼠，计算雌性小鼠出生率；选择雌鼠出生率在预设值以上的胚胎干细胞作为所述雌性胚胎干细胞；优选地，所述预设值为28％，更优选为30％。5.一种制备嵌合体胚胎的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1所述的雌性胚胎干细胞与四倍体胚胎细胞聚合，形成所述嵌合体胚胎。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将小鼠的胚胎细胞置于电融合液中，进行电融合，获得四倍体胚胎细胞的步骤；优选地，所述胚胎细胞为2
‑
细胞胚胎细胞；优选地，所述小鼠选自C57BL/6小鼠、B6C3F1小鼠和CD

【专利技术属性】
技术研发人员：邹娜，
申请(专利权)人：广州明迅生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：