一种人胚胎干细胞与前列腺癌细胞共培养制备抗前列腺癌药物的方法技术

本发明专利技术提供一种人胚胎干细胞与前列腺癌细胞共培养制备抗前列腺癌药物的方法。人胚胎干细胞能在体外培养、具有发育全能性的干细胞，具有高度的自我更新、无限增殖以及多向分化的能力。发明专利技术人意外发现，将人胚胎干细胞和前列腺癌细胞进行直接接触共培养，人胚胎干细胞微环境受到其他肿瘤细胞的刺激，会产生抑癌生物学效应，而产生“抑肿瘤”分子，因此可以提取上清液运用到前列腺癌的治疗。本发明专利技术的共培养上清液在抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭方面表现出显著的治疗效果；更重要的是，共培养上清液在体内抑制肿瘤的生长方面也表现出明显的优势，具有制备成抗前列腺癌药物的潜力。力。力。

【技术实现步骤摘要】
一种人胚胎干细胞与前列腺癌细胞共培养制备抗前列腺癌药物的方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种人胚胎干细胞与前列腺癌细胞共培养制备抗前列腺癌药物的方法。

技术介绍

[0002]前列腺癌(Prostate cancer，PCa) 是一种好发于老年男性的恶性肿瘤，其发病率随年龄增加而增长。前列腺癌在全世界范围内都具有较高的发病率。每年全球有90多万新发病例，其中26万多病例因前列腺癌的恶化而死亡。欧美国家前列腺癌的发病率明显高于亚非地区。在美国，前列腺癌占美国男性肿瘤发病率的第一位。在我国，前列腺癌的发病率较以往增长了近70％。根据《临床肿瘤学杂志》 2013年第04期关于中国前列腺癌发病现状和流行趋势分析的报道，我国前列腺癌的发病率呈现明显的持续增长趋势，前列腺癌正成为严重影响我国男性健康的泌尿系统恶性肿瘤。随着我国社会老龄化现象日趋严重，我国前列腺癌的发病率可能会进入高峰期。前列腺癌的临床表现主要为排尿困难，呈渐进性地出现尿频、尿急、血尿等症状并伴随排尿时的疼痛感或灼烧感及背下部、大腿上部或骨盆处的连续疼痛。前列腺癌肿瘤初期无任何临床表现，常以出现转移症状为最早的就诊原因。由于前列腺癌潜伏期较长，因而很难察觉，发现时一般已经发展为晚期。
[0003]前列腺癌的生长和转移密切依赖于雄激素(如双氢睾酮)。雄激素的分泌约90％来自于睾丸。雄激素被分泌后进入细胞可以与雄激素受体结合。雄激素受体是一种重要的核转录因子，调控众多的基因表达和前列腺癌细胞增殖。当雄激素与雄激素受体结合后，雄激素受体进入细胞核启动基因表达，从而促进前列腺癌生长和转移。因此，去雄激素治疗(包括切除睾丸和药物抑制雄激素水平)对于大多数前列腺癌有明显疗效。但去雄激素治疗对肿瘤的控制一般仅能维持1
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4年，几乎所有前列腺癌患者最终均转为雄激素非依赖性前列腺癌，进而发展为去势抵抗性前列腺癌。此时，去雄激素治疗也就失去了效果。去势抵抗性前列腺癌是导致前列腺癌病人死亡的重要原因。去势抵抗性前列腺癌的发生机制有很多种，包括雄激素受体突变、雄激素受体表达消失以及在低雄激素环境下雄激素不敏感的细胞群扩增等。虽然去雄激素治疗没有效果，但是在大多数去势抵抗性前列腺癌中雄激素受体也同样扮演着重要的角色，所以雄激素受体是目前治疗普通前列腺癌和去势抵抗性前列腺癌的重要靶点。
[0004]当今全球医疗界尚没有一种药物能单独治愈前列腺癌。前列腺癌的主要治疗手段 包括手术、放疗、化疗及生物治疗，不仅患者要经历九死一生之痛，家庭经济压力巨大，负债累累，人们最不能接受的是患病亲人承受了极大痛苦后最终还是要经历生死离别之苦。美国食品和药物管理局(FDA)最新批准的治疗去势抵抗性前列腺癌的药物包括Abiraterone和Enzalutamide，前者是抑制雄激素的合成，后者是雄激素受体的拮抗剂，这两种药物都是针对雄激素受体信号通路，在去势抵抗性前列腺癌的治疗方面取得显著疗效，但是经过内分泌治疗及靶向雄激素受体药物治疗后，病人依然会产生药物抵抗，治疗效果十分有限，且
费用昂贵。此外，放化疗所引起的副作用也是临床治疗的瓶颈。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术中的问题，本专利技术提供一种人胚胎干细胞与前列腺癌细胞共培养制备抗前列腺癌药物的方法。专利技术人意外发现，将人胚胎干细胞和前列腺癌细胞进行直接接触共培养，人胚胎干细胞微环境受到前列腺癌细胞的刺激，会产生抑癌生物学效应，而产生“抑前列腺癌”分子，再提取上清液运用到肿瘤的治疗中。本专利技术在共培养过程中使用专用的胚胎干细胞培养基可以尽可能的保持人胚胎干细胞的特性，利用合适状态下的胚胎干细胞及合适的胚胎干细胞和前列腺癌细胞比例进行共培养，共培养体系中两种细胞的比例不合适和加入前列腺癌细胞的时间点不合适，都不能使人胚胎干细胞产生强烈的抑制肿瘤生长的生物学效应。
[0006]除特殊说明外，本专利技术所述份数均为重量份，所述百分比均为质量百分比。
[0007]本专利技术提供一种人胚胎干细胞与前列腺癌细胞共培养制备抗前列腺癌药物的方法。
[0008]为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：一种人胚胎干细胞与前列腺癌细胞共培养制备抗前列腺癌药物的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）预铺Matrigel基质胶制备人胚胎干细胞专用培养板；（2）人胚胎干细胞进行消化传代；（3） 使用步骤（1）预铺的Matrigel基质胶制备人胚胎干细胞专用培养板进行人胚胎干细胞接种；（4）取对数生长期的前列腺癌细胞，吸弃培养基后加入DPBS缓冲液清洗细胞，用EDTA于32
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42℃消化2
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6 min，吸去上清液，用人胚胎干细胞完全培养基将前列腺癌细胞重悬为单个细胞悬液，将前列腺癌细胞数按培养体系中人胚胎干细胞的1：1
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1：5比例，加入到人胚胎干细胞培养体系中，将两种细胞在32
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42℃的CO2细胞培养箱中进行共培养；（5）共培养24
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96h后收取共培养液。
[0009]本专利技术所述人胚胎干细胞为已建立的干细胞系。
[0010]在研究过程中，专利技术人发现，使用含FBS的培养基用于人胚胎干细胞与癌细胞共培养，含FBS的培养基会诱导人胚胎干细胞分化，进而诱导细胞增加生长。经过大量实验后发现，专利技术人围绕胚胎微环境受到肿瘤细胞刺激后所产生的抑制肿瘤生长的生物学效应展开，优化人胚胎干细胞和癌细胞进行共培养方法，并提取共培养上清液后发现其抗前列腺癌作用。
[0011]上述培养基包括PSCeasy
®
人多潜能干细胞培养基、mTeSR
TM1
培养基、Essential 8
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培养基、DMEM/F12培养基的一种或两种。
[0012]所述人胚胎干细胞与癌细胞共培养液优选人胚胎干细胞与癌细胞共培养的上清液。
[0013]所述预铺Matrigel基质胶制备人胚胎干细胞专用培养板的方法为将Matrigel稀释后进行预铺细胞培养孔板，在37℃恒温CO2细胞培养箱中放置4
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12小时。
[0014]Matrigel稀释为Matrigel用DPBS稀释，其中Matrigel：DPBS=1：30
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1：50。
[0015]人胚胎干细胞进行消化传代的方法为选取传代培养中的人胚胎干细胞，吸弃培养基后加入DPBS缓冲液清洗细胞，加入细胞解离试剂干细胞消化液，放入培养箱中孵育，显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离皿底，克隆内部大部分细胞间出现较为明显的间隙，肉眼观察到细胞集落变得不透明且发白，表明细胞消化时间理想，吸弃干细胞消化液，加入干细胞培养基，将细胞刮轻刮细胞成几十个细胞团块。
[0016]选取传代培养中的人胚胎干细胞，是选取覆盖率80％
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90%、克隆边缘平滑且无分化细胞的培养孔，并传代次数为2
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10代。
[0017]人胚胎干细胞接种的方法为取步骤(1)的孔板，吸弃配制本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人胚胎干细胞与前列腺癌细胞共培养制备抗前列腺癌药物的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)预铺Matrigel基质胶制备人胚胎干细胞专用培养板；(2)人胚胎干细胞进行消化传代；(3)使用步骤(1)预铺的Matrigel基质胶制备人胚胎干细胞专用培养板进行人胚胎干细胞接种；(4)取对数生长期的前列腺癌细胞，吸弃培养基后加入DPBS缓冲液清洗细胞，用EDTA于32
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42℃消化2
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6min，吸去上清液，用人胚胎干细胞完全培养基将前列腺癌细胞重悬为单个细胞悬液，将前列腺癌细胞数按培养体系中人胚胎干细胞的1：1
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1：5比例，加入到人胚胎干细胞培养体系中，将两种细胞在32
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42℃的CO2细胞培养箱中进行共培养；(5)共培养24
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96h后收取共培养液；所述人胚胎干细胞为已建立的干细胞系。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述培养基包括人多潜能干细胞培养基、mTeSR
TM1
培养基、Essential 8
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培养基、DMEM/F12培养基的一种或两种。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述预铺Matrigel基质胶制备人胚胎干细胞专用培养板的方法为将Matrigel稀释后进行预铺细胞培养孔板，在37℃恒温CO2细胞培养箱中放置4
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12小时；所述Matrigel稀释为Matrigel用DPBS稀释，其中Matrigel：DPBS＝1：30
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【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书一页说明书五页附图三页，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：