一种拟胚体大规模生产的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种拟胚体大规模生产的方法及应用，属于拟胚体技术领域。所述拟胚体大规模生产的方法，包括如下步骤：步骤(1)：制备分散相；步骤(2)：制备油包水液滴；步骤(3)：紫外光照射。本发明专利技术能够实现拟胚体大规模工业化生产，得到的拟胚体大小均一，操作简单，成本低廉，对设备要求低，生产效率高，市场前景广阔。市场前景广阔。市场前景广阔。

【技术实现步骤摘要】
一种拟胚体大规模生产的方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种拟胚体大规模生产的方法及应用，属于拟胚体


技术介绍

[0002]胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell,简称ES)或诱导多能干细胞(induced Pluripotent Stem cells，简称iPS)是在体外一定的培养条件下形成的，具有内、中、外三胚层结构，形态学上与哺乳动物早期的胚胎发育阶段有着很高相似度的一种球状结构，又被称为拟胚体(Embryoid bodies，EB，简称EBs)。目前很多分化系统都是基于拟胚体分化体系建立的，如造血干细胞、自然杀伤细胞、神经干细胞和心肌细胞等，其分化策略都是先制备出拟胚体，然后用不同的措施定向诱导分化为目的细胞。之所以经拟胚体途径,目的是模拟体内胚胎发育过程,拟胚体中的内、中、外三胚层的细胞互相支持,互相提供分化生长的微环境。
[0003]现有技术中，拟胚体的生产方法主要有自发形成法、悬滴法和离心法三种，均存在弊端，具体如下：
[0004]自发形成法：是将细胞团块悬浮在康宁(Corning)低附着培养皿或聚HEMA涂层培养皿中，通过数量比为1:1传代到一个康宁(Corning)低附着培养皿中，以便在37℃培养箱中过夜自聚集。第二天，形成各种尺寸的拟胚体。该方法的缺点是形成的拟胚体大小不均一，无法进行质量控制，导致后续分化工艺不稳定，无法大规模培养。
[0005]悬滴法：为了形成悬滴拟胚体，将单细胞滴(2000个细胞/20μL)悬垂培养在培养皿的盖子上，再将培养皿的盖子在37℃培养箱中孵育过夜。第二天形成大小一致的拟胚体。该方法能够形成大小均一的拟胚体，缺点是操作复杂，单位容器面积下产生拟胚体效率低，对人员操作要求高，人力成本高，无法完成大规模生产。
[0006]离心法：使用前用DMEM/F12冲AggreWell培养板的每个孔。将1.5
×
106个细胞/1.5mL添加到每个孔以生成所需大小的拟胚体。以100
×
g离心AggreWell板3min
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5min。将AggreWell培养板在37℃培养箱中孵育过夜。第二天形成统一大小的拟胚体。在AggreWell培养板中轻轻地上下移取培养基以去除拟胚体微孔并将它们转移到康宁(Corning)低附着培养皿或聚HEMA涂层培养皿。该方法能够形成大小均一的拟胚体，缺点在于大规模培养时，需要频繁使用离心机，还需要使用大量AggreWell培养板，人力和物力成本高，时间长，不适合大规模工业化生产。
[0007]随着细胞治疗技术的发展，传统的科研型拟胚体形成方法满足不了大规模工业生产的需求。鉴于此，有必要提供一种大规模工业化生产拟胚体的方法，以提供大小均一，品质可控的拟胚体，以克服现有技术的不足。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的之一，是提供一种拟胚体大规模生产的方法。
[0009]本专利技术解决上述问题的技术方案如下：一种拟胚体大规模生产的方法，包括如下
步骤：
[0010]步骤(1)：制备分散相
[0011]取iPSC单细胞，加入DPBS缓冲液，配置成浓度为5万/mL
‑
200万/mL的细胞悬液；
[0012]将上述细胞悬液与生物水凝胶进行混合，直至混合物中生物水凝胶的质量百分浓度为2％
‑
5％；
[0013]再加入交联剂，得到分散相，分散相中生物水凝胶的质量百分浓度为1％；
[0014]步骤(2)：制备油包水液滴
[0015]通过第一移液枪枪头将步骤(1)得到的分散相注入到微流控装置的液相通道中；
[0016]通过第二移液枪枪头将油相注入到微流控装置的油相通道中；
[0017]在液相通道和油相通道的交汇处，形成大小均一的油包水液滴；
[0018]步骤(3)：紫外光照射
[0019]将步骤(2)得到的油包水液滴，进行紫外光照射,即得到拟胚体。
[0020]本专利技术的大规模生产拟胚体的方法的原理说明：
[0021]第一点，本专利技术的步骤(1)中，iPSC由授权专利CN202110690889.0说明书第0125段
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第0153段中实验组的方法制备而得。IPSC也可以由专利申请CN201910110768.7或专利申请CN202110733296.8中的制备方法制备而得，还可以由本领域公知方法或商品化试剂盒制备而得。
[0022]生物水凝胶在使用前需要用0.22μm无菌过滤头过滤除菌。过滤损耗与浓度成正比，浓度越高损耗越多。混合物中生物水凝胶的质量百分浓度为2％
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5％，可以保证过滤损耗率＜10％。
[0023]第二点，本专利技术的步骤(2)中，现有技术中，并没有微流控装置用于生产拟胚体的报道。本专利技术的专利技术人经过长期大量的试验摸索，惊喜且意外地发现，该微流控装置用于生产拟胚体，得到的拟胚体大小均一，能够流水线式自动化形成，适合大规模生产。
[0024]上述微流控装置可以市售购买，如可以购自上海澎赞生物科技有限公司。
[0025]本专利技术的拟胚体大规模生产的方法的有益效果是：
[0026]本专利技术能够实现拟胚体大规模工业化生产，得到的拟胚体大小均一，操作简单，成本低廉，对设备要求低，生产效率高，市场前景广阔。
[0027]在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进。
[0028]进一步，步骤(1)中，所述生物水凝胶为甲基丙烯酸化水凝胶、聚乙醇酸、聚乳酸、羟基烷酸酯、丁二酸丁二醇酯、聚己内酯、胶原蛋白和基质胶中的任意一种。
[0029]采用上述进一步的有益效果是：上述材料均可以作为生物水凝胶，能达到相同的技术效果。
[0030]优选地，所述生物水凝胶为甲基丙烯酸化水凝胶。
[0031]更进一步，所述甲基丙烯酸化水凝胶由如下方法制备而成：
[0032]步骤(1.1)：取10.0g明胶，使用磁力搅拌器，于60℃溶解在100mL的DPBS缓冲液中，得到溶液Ⅰ；
[0033]步骤(1.2)：在溶液Ⅰ中，加入8.0mL甲基丙烯酸酐，使用磁力搅拌器，于50℃剧烈搅拌下反应3h，得到溶液Ⅱ；
[0034]步骤(1.3)：在溶液Ⅱ中，加入五倍溶液Ⅱ体积的40℃的DPBS缓冲液，得到溶液Ⅲ；
[0035]步骤(1.4)：使用SnakeSkin透析袋，将溶液Ⅲ透析5d
‑
10d，得到溶液Ⅳ，即为甲基丙烯酸化水凝胶；
[0036]采用上述进一步的有益效果是：上述甲基丙烯酸化水凝胶是由明胶经过甲基丙烯酸酐改性而成，通过甲基丙烯酸酐的羧基与明胶上的羟基反应，将碳碳双键引入明胶中，使得甲基丙烯酸化水凝胶可在光引发剂的作用下，通过光固化原理对细胞进行包覆，形成拟胚体结构。
[0037]其中，步骤(1.3)中，在溶液Ⅱ中，加入溶液Ⅱ五倍体积的40℃的DPBS缓冲液，是为了终止反应。
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种拟胚体大规模生产的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤(1)：制备分散相取iPSC单细胞，加入DPBS缓冲液，配置成浓度为5万/mL
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200万/mL的细胞悬液；将上述细胞悬液与生物水凝胶进行混合，直至混合物中生物水凝胶的质量百分浓度为2％
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5％；再加入交联剂，得到分散相，分散相中生物水凝胶的质量百分浓度为1％；步骤(2)：制备油包水液滴通过第一移液枪枪头将步骤(1)得到的分散相注入到微流控装置的液相通道中；通过第二移液枪枪头将油相注入到微流控装置的油相通道中；在液相通道和油相通道的交汇处，形成大小均一的油包水液滴；步骤(3)：紫外光照射将步骤(3)得到的油包水液滴，进行紫外光照射,即得到拟胚体。2.根据权利要求1所述的拟胚体大规模生产的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述生物水凝胶为甲基丙烯酸化水凝胶、聚乙醇酸、聚乳酸、羟基烷酸酯、丁二酸丁二醇酯、聚己内酯、胶原蛋白和基质胶中的任意一种；优选地，所述生物水凝胶为甲基丙烯酸化水凝胶。3.根据权利要求2所述的拟胚体大规模生产的方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸化水凝胶由如下方法制备而成：步骤(1)：取10.0g明胶，使用磁力搅拌器，于60℃溶解在100mL的DPBS缓冲液中，得到溶液Ⅰ；步骤(2)：在溶液Ⅰ中，加入8.0mL甲基丙烯酸酐，使用磁力搅拌器，于50℃剧烈搅拌下反应3h，得到溶液Ⅱ；步骤(3)：在溶液Ⅱ中，加入五倍溶液Ⅱ体积的40℃的DPBS缓冲液，得到溶液Ⅲ；步骤(4)：使用SnakeSkin透析袋，将溶液Ⅲ透析5d
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【专利技术属性】
技术研发人员：吴理达，顾雨春，
申请(专利权)人：呈诺再生医学科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：