一种外泌体分泌诱导剂、诱导培养基及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种外泌体分泌诱导剂、诱导培养基及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术提供的外泌体分泌诱导培养基仅可包含基础培养基和四种添加物：L

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体分泌诱导剂、诱导培养基及其应用
[0001]本申请为申请日2020年12月31日、申请号202011636845.1、专利技术名称“一种外泌体分泌诱导剂及诱导培养基和应用其的外泌体的生产方法及应用”的分案申请。


[0002]本专利技术属于生物
，具体涉及一种外泌体分泌诱导剂及诱导培养基和应用其的外泌体的生产方法及应用，尤其涉及外泌体在制备改善衰老细胞情况和/或保护神经元的药物中的应用。

技术介绍

[0003]外泌体是包含了复杂RNA和蛋白质的特异性分泌的小膜泡(30～150nm)，其参与细胞间通讯，调节多种组织器官的正常功能和损伤修复。
[0004]由于来源于不同的组织的外泌体具有其特异性蛋白分子和其行使功能的关键分子，因此来源于干细胞的外泌体具备干细胞的重要治疗作用且更加安全，可以有效转运具有疾病治疗作用的RNA和蛋白质等生物活性物质，具有抑制细胞凋亡、抑制炎症反应、促进血管生成、抑制纤维化、提高组织修复潜力等重要生物学功能。另外，外泌体还能够穿透血脑屏障，并且能够递送小分子药物等各种治疗分子，具有非常广阔的临床应用前景，因此从干细胞中高效生产获得这一类外泌体尤为重要。现有外泌体获取方式主要是细胞自分泌，然而其产量非常有限。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本专利技术的一个方面提供一种外泌体分泌诱导剂，其包含以下使用浓度的成分：
[0006][0007]本专利技术另一方面提供一种外泌体分泌诱导培养基，其包含基础培养基和以下浓度的成分：
[0008][0009][0010]且所述外泌体分泌诱导培养基不包含Transferrin、FGF2和TGFβ1/NODAL的组合。
[0011]上述外泌体分泌诱导培养基为基础培养基和以下浓度的成分：
[0012][0013]上述基础培养基为DMEM/F12。
[0014]本专利技术另一方面还提供一种生产外泌体的方法，其包括以下步骤：
[0015]1)将对数生长期且生长状态良好的干细胞贴壁培养至覆盖率达到60％～70％；
[0016]2)换用上述的外泌体分泌诱导培养基对步骤1)贴壁培养的干细胞进行外泌体分泌诱导培养20～30小时，取上清收获含外泌体的细胞培养液；
[0017]3)从步骤2)收获的含外泌体的细胞培养液中分离获得外泌体；
[0018]优选地，重复步骤2)2～3次，合并每次收获的含外泌体的细胞培养液，从所述合并的细胞培养液中分离获得外泌体。
[0019]上述方法中，步骤1)中所述干细胞选自胚胎干细胞、诱导多能干细胞和间充质干细胞。
[0020]上述方法中，步骤3)中所述分离的方法包括差速离心法、超滤离心法、密度梯度离心法、沉淀法、磁珠免疫法、PS亲和法、色谱法。
[0021]上述方法生产的外泌体或含外泌体的细胞培养液也在本专利技术的保护范围之内，所述外泌体的数量达到外泌体在干细胞中的分泌量≥1000个/细胞，所述外泌体的粒径为30～150nm(主要为50～80nm)，表面标志物中CD9占比≥23％，CD63占比≥10％。
[0022]上述的外泌体在制备改善衰老细胞情况和/或保护神经元的药物中的应用也属于本专利技术的内容。基于此，本专利技术还提供一种改善衰老细胞情况和/或保护神经元的药物，其包含上述的外泌体。
[0023]基于以上技术方案，本专利技术首次提供一种用于高效外泌体生产的外泌体分泌诱导剂，其可以仅包含L
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抗坏血酸或其盐、硒或其盐、NaHCO3和胰岛素四种成分，因此成分简单，并且当将其和用于干细胞(例如ESC或iPSC等)培养的基础培养基(例如DMEM/F12)组成外泌体分泌诱导培养基对贴壁生产良好的干细胞进行诱导培养时，可以显著促进干细胞中外泌体的分泌，进而显著提高外泌体的产量。实施例结果表明，使用本专利技术提供的外泌体分泌诱导培养基诱导培养贴壁良好的iPSC细胞的外泌体的产量(即分泌量)高达1000个/细胞以上。实施例结果还表明，本专利技术生产获得的外泌体可以在脑卒中神经元模型(糖氧剥夺试验，OGD)和脑卒中神经元模型(糖氧剥夺试验)中有效保护大鼠皮层神经元，同时可以有效保护氧化损伤造成的人类皮层神经元轴突断裂。
附图说明
[0024]图1为分别采用GDEV培养基、E8培养基培养iPSC细胞以及采用MSC培养基培养MSC细胞的外泌体产量柱状图；
[0025]图2为外泌体溶液中粒子浓度与粒径大小分布关系图；
[0026]图3为纳米流式检测外泌体表面标志物CD9与CD63的直方图；
[0027]图4为外泌体的电镜照片；
[0028]图5为人皮肤成纤维细胞、脐带间充质干细胞和神经元细胞摄入外泌体的Hoechst 33342染色照片；
[0029]图6为脑卒中神经元模型中死细胞统计柱状图；
[0030]图7为人类皮层神经元损伤模拟Calcein AM/Hoechst染色照片；
[0031]图8为人类皮层神经元长度统计柱状图；
[0032]图9为脑卒中神经元模型中小鼠生存曲线；
[0033]图10为脑卒中神经元模型中小鼠脑梗死面积统计图。
具体实施方式
[0034]针对现有技术中存在的细胞自分泌的外泌体的产量低以及还没有用于外泌体生产的外泌体分泌诱导剂和外泌体分泌诱导培养基的缺陷，本专利技术旨在提供一种用于从干细胞(ESC或iPSC等)中高效生产外泌体且成分简单的外泌体分泌诱导剂和外泌体分泌诱导培养基，还提供了利用该诱导培养基生产外泌体的方法及生产获得的外泌体的应用。
[0035]Guokai Chen等人(文献1：Guokai Chen等.Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture，NATURE METHODS，2011年4月10日)和Senquan Liu等人(文献2：Senquan Liu等.Highly Purified Human Extracellular Vesicles Produced by Stem Cells Alleviate Aging Cellular Phenotypes of Senescent Human Cells，STEM CELLS，2019年2月27日)采用E8培养基常规培养干细胞(ESC或iPSC)，已经证明可以改善干细胞ESC和iPSC的衍生效率，E8培养基包含：DMEM/F12、L
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Ascorbic Acid(L
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抗坏血酸)、Selenium(硒)、Transferrin(转铁蛋白)、NaHCO3、Insulin(胰岛素)、FGF2、TGFβ1/NODAL，其中Insulin和FGF2对于细胞存活和增殖是重要的，L
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Ascorbic Acid促进ESC的增殖，Selenium对于持续培养扩繁至关重要，Transferrin有助于提高克隆效本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外泌体分泌诱导剂，其特征在于，所述外泌体分泌诱导剂为以下使用浓度的成分：2.一种外泌体分泌诱导培养基，其特征在于，所述外泌体分泌诱导培养基包含基础培养基和以下浓度的成分：且所述外泌体分泌诱导培养基不包含Transferrin、FGF2和TGFβ1/NODAL的组合。3.根据权利要求2所述的外泌体分泌诱导培养基，其特征在于，所述外泌体分泌诱导培养基为基础培养基和以下浓度的成分：4.根据权利要求2或3所述的外泌体分泌诱导培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12。5.权利要求1所述的外泌体分泌诱导剂或...

【专利技术属性】
技术研发人员：张建民，王靓，曲典，林埕宇，
申请(专利权)人：国典北京医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：