【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞生物学和再生医学领域，涉及一种诱导多能干细胞分化为成骨细胞和骨细胞的方法及应用。
技术介绍
1、骨组织再生受限，治疗大面积颅骨缺损一直是临床的挑战。近年来，随着3d打印技术和生物材料的发展，骨组织工程技术以支架材料、种子细胞和生长因子为基础，研发出生物活性骨植入物，具备出色的生物相容性、骨传导性和骨诱导性，能精确填充颅骨缺损并促进新骨生长(bhushan et al.,2022.bioengineering)。这些生物活性骨植入物不仅规避了自体骨和异体骨的限制、免疫排斥和手术风险，还提供了个性化和高效的治疗方法，为颅骨缺损修复领域带来了突破性进展。
2、然而，如何获得大量的功能性成骨细胞仍然是骨组织工程和动物模型中骨再生效果的关键挑战。传统上，骨髓间充质干细胞(bmscs)是颅骨缺损修复中最常用的种子细胞，它们能够促进颅骨再生和修复(zhao et al.,2021.stem cells int)。然而，bmscs存在来源受限、批次不稳定、细胞老化以及分化异质性等问题(vizoso et al.,2019.int j molsci)，难以满足未来骨组织工程的大规模需求。
3、最新的骨组织工程种子细胞来源是诱导多能性干细胞(hipsc)，它们可以通过定向诱导分化为成骨细胞和骨细胞，从而促进新骨组织的生成，具有巨大潜力(chen et al.,2022.bioact mater)。hipscs分化为成骨细胞和骨细胞通常包括三个阶段：首先，hipscs经过小分子诱导分化为中胚层间充质干细胞；然
技术实现思路
1、为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种诱导多能干细胞分化为成骨细胞和骨细胞的方法。本专利技术的分化方法可将分化时间大大缩短，分化14天即可形成成骨细胞，分化21天即可形成骨细胞。此外，本专利技术获得的成骨细胞可在体外稳定快速地增殖，传代至p12时依然可以正常扩增且维持标志物表达。
2、本专利技术通过以下技术方案实现：
3、一种诱导多能干细胞分化为成骨细胞和骨细胞的方法，包括以下步骤：
4、s1：ipsc分化形成拟胚体；
5、s2：拟胚体向肌腱祖细胞分化；
6、s3：肌腱祖细胞向成骨细胞分化；
7、s4：成骨细胞向骨细胞分化。
8、进一步，在s1中，将ipsc消化后用添加了10μm rock抑制剂的e8培养基悬浮培养，形成拟胚体；
9、更进一步，所述rock抑制剂为y27632；
10、更进一步，所述ipsc按照1.5×106cells/ml的细胞密度接种于低吸附6孔板中。
11、进一步，在s2中，先将拟胚体在添加了250nm ldn193189的e8培养基中悬浮培养2天，再在添加了250nm ldn193189、5um chir和100nm agn193109的e8培养基中悬浮培养4天，形成肌腱祖细胞；
12、更进一步，在培养期间每隔一天更换一次新鲜培养基。
13、进一步，在s3中，将肌腱祖细胞接种于预先包被matrigel的孔板中，加入d6-eb om培养基贴壁培养7天，形成成骨细胞；
14、所述d6-eb om培养基由dmem高糖培养基、1％its-g、10％fbs、1mmβ-甘油2-磷酸二钠水合物、50ug/ml l-抗坏血酸2-磷酸、20ng/ml fgf-2、100nm地塞米松、1％glutamax、1％neaa、1％ penicilin-streptomycin、1μm视黄酸组成。
15、进一步，在s4中，将成骨细胞在所述d6-eb om培养基中培养7天，形成骨细胞，所述骨细胞有钙结节沉淀。
16、进一步，所述s3后还包含s30：将成骨细胞进行扩增传代培养。
17、更进一步，在s30中，在成骨细胞汇合度达到90％-95％时，用om培养基进行传代培养；
18、所述om培养基由dmem高糖培养基、1％its-g、10％fbs、1mmβ-甘油2-磷酸二钠水合物、50ug/ml l-抗坏血酸2-磷酸、20ng/ml fgf-2、100nm地塞米松、1％glutamax、1％neaa、1％ penicilin-streptomycin组成。
19、在一个具体的实施方案中，所述传代培养的步骤如下：待所述成骨细胞汇合度达到90-95％时，用dpbs清洗一遍，并用0.25％trypsin-edta于37℃ 5％co2培养箱消化3min，加入含fbs的培养基终止消化，1200rpm 3min离心收集细胞沉淀，用om培养基重悬并接种细胞。
20、本专利技术提供了成骨细胞和骨细胞在制备治疗颅骨缺损的药物中的应用。
21、“诱导多能干细胞(ipsc)”指通过人工诱导某些基因的表达从某些成体细胞(如成纤维细胞)获得的具有全能性或多能性的干细胞。在本领域已知的一些方法中，可通过将某些干细胞相关基因转染到非多能细胞如成体成纤维细胞来获得ipsc。转染可以通过使用病毒如逆转录病毒或慢病毒的病毒转导来实现。在一些方法中，转染基因可包括转录因子oct4、sox2、klf4和c-myc，尽管同时转染其他基因有可能提高诱导效率。在另一些方法中，可利用慢病毒系统采用oct4、sox2、nanog和lin28基因转化体细胞。在ipsc中诱导表达的基因包括但不限于oct-3/4；sox基因家族的某些成员(例如soxl、sox2、sox3和sox15)；klf家族的某些成员(例如klfl、klf2、klf4和klf5)、myc家族的某些成员(例如c-myc、l-myc和n-myc)、nanog、lin28、tert、fbx15、eras、ecat15-1、ecat15-2、tcl1、β-catenin、ecat1、esg1、dnmt3l、ecat8、gdf3、fth117、sal14、rex1、utf1、stella、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种诱导多能干细胞分化为成骨细胞和骨细胞的方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S1中，将iPSC消化后用添加了10μM Rock抑制剂的E8培养基悬浮培养，形成拟胚体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S2中，先将拟胚体在添加了250nMLDN193189的E8培养基中悬浮培养2天，再在添加了250nM LDN193189、5uM CHIR和100nMAGN193109的E8培养基中悬浮培养4天，形成肌腱祖细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S3中，将肌腱祖细胞接种于预先包被Matrigel的孔板中，加入D6-EB OM培养基贴壁培养7天，形成成骨细胞；
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S4中，将成骨细胞在所述D6-EB OM培养基中培养7天，形成骨细胞，所述骨细胞有钙结节沉淀。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S3后还包含S30：将成骨细胞进行扩增传代培养。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在S30中，在成骨细
8.权利要求1-7任一项所述的成骨细胞和骨细胞在制备治疗颅骨缺损的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种诱导多能干细胞分化为成骨细胞和骨细胞的方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在s1中，将ipsc消化后用添加了10μm rock抑制剂的e8培养基悬浮培养，形成拟胚体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在s2中，先将拟胚体在添加了250nmldn193189的e8培养基中悬浮培养2天，再在添加了250nm ldn193189、5um chir和100nmagn193109的e8培养基中悬浮培养4天，形成肌腱祖细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在s3中，将肌腱祖细胞接种于预...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋宗敏，刘子嶷，任文文，顾雨春，吴理达，
申请(专利权)人：呈诺再生医学科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：
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