【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术、生物医药领域，具体涉及一种融合蛋白组合物及其应用。
技术介绍
1、癌症作为一种恶性疾病，每年在全世界造成近千万人的死亡。针对癌症的治疗方法也在不断发展，除去传统的手术、化疗和放疗等方法，近年来出现了干细胞疗法、靶向疗法、免疫疗法和基因疗法等多种新型治疗方法。基因疗法大致有四个方向：(1)递送直接诱导癌细胞死亡的基因；(2)递送表达具有正常功能的抑癌基因；(3)递送表达能诱发抗肿瘤免疫反应的基因；(4)沉默致癌基因的表达。递送基因直接诱导癌细胞死亡的疗法，需要对递送表达的特异性提出更高的要求，以避免对正常细胞造成“误杀”。
2、白喉毒素(diphtheria toxin，dt)是由白喉棒状杆菌(corynebacteriumdiphtheriae)分泌的蛋白质类外毒素。白喉毒素由三个不同的区域组成：n端催化区、中间穿膜区、c端受体结合区，n端催化区是毒性结构域(diphtheria toxinfragment a，dta)，具有抑制哺乳动物细胞蛋白合成的能力，能诱导细胞死亡，常被用在定向药物中作为杀伤因子使用。dta本质为蛋白质，能够作为基因疗法中的目的基因被递送表达，最终杀死肿瘤细胞。
3、内含肽(inteins)是未成熟蛋白中一部分，主导了蛋白翻译后修饰中的可变剪接过程，催化其自身从相邻的外显肽(exteins)中切除，同时将两段相邻的外显肽使用肽键连接，获得成熟的蛋白。蛋白反式剪接(protein trans-splicing,pts)是可变剪接的一种，内含肽本身以被分割成两段
4、由于直接递送完整的白喉毒素基因会杀伤机体正常细胞，使机体产生严重的中毒反应。因此，现有技术中一般将dta与内含肽联合使用，dta的dna序列被分成两部分，分别与内含肽的两段肽段融合后形成两条独立表达的融合肽链，之后再利用内含肽的反式剪接原理，在体内形成完整的dta蛋白。
5、但是，目前在dta与内含肽的联合使用中，还存在诸多缺陷：(1)使用中需要至少一种带有内含肽修饰分割的蛋白制剂，该蛋白的氨基酸序列主要来源于白喉杆菌、念珠藻和炭疽杆菌等非哺乳类生物，在使用中会因其序列结构非人源而产生预期以外的免疫反应，同时还将影响其功能且无法多次给药。(2)需要将靶标细胞提前改造，使其表达异源的穿膜受体蛋白后，才能实现dta的细胞杀伤功能，限制了使用范围，提高了使用的难度，同样有可能导致靶标细胞的免疫原性提高，造成预期以外的免疫反应。当前技术中，内含肽修饰分割的dta蛋白制剂添加在细胞膜外，蛋白组分无法直接穿过细胞膜进入细胞内发挥功能，需要借助炭疽杆菌来源的蛋白转运系统，不仅dta蛋白制剂需要额外融合配套的“致死因子”(蛋白编号1jky)n端氨基酸序列，在靶标细胞中也需要提前递送表达“保护性抗原”(蛋白质编号1acc)。(3)专利文献us20200407405a1在将dta的氨基酸序列分割成两段并融合内含肽修饰时，在内含肽的c端段和dta的c端段之间插入了额外的氨基酸用于剪接，使最终剪接获得的完整dta内部掺杂了多余氨基酸残基，改变了dta的序列，引入了新的不确定因素。(4)专利文献cn105925596a中的两个反式剪接底物分别是导向部分多肽和毒性部分多肽，其毒性部分多肽具有细胞毒性，若缺乏导向多肽的引导，可造成对正常组织的毒杀作用。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的不足，本专利技术提供了一种融合蛋白组合物及其应用，基于内含肽的反式剪接原理，选取新的分割位点对dta氨基酸序列进行分割，分割后的两个dta片段分别与内含肽的两个分裂片段融合形成两个融合蛋白，融合时没有在dta和内含肽之间添加新的氨基酸，使两条分割后的dta肽链在重新剪接后，获得的完整dta氨基酸序列与天然存在的野生型完全一致，降低了不明序列带来的潜在风险。
2、本专利技术提供的技术方案如下：
3、本专利技术的第一方面提供了一种融合蛋白组合物，所述融合蛋白组合物包括第一融合蛋白和第二融合蛋白，所述第一融合蛋白包含第一分裂内含肽和第一外显肽；所述第二融合蛋白包含第二分裂内含肽和第二外显肽；
4、所述第一外显肽的氨基酸序列和所述第二外显肽的氨基酸序列连接构成白喉毒素毒性结构域的氨基酸序列；
5、所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白在细胞中共同表达导致第一外显肽和第二外显肽的反式剪接以在细胞中形成所述白喉毒素毒性结构域。
6、优选地，所述第一分裂内含肽是n-内含肽，所述n-内含肽的氨基酸序列如seq idno:1所示；
7、所述第二分裂内含肽是c-内含肽，所述c-内含肽的氨基酸序列如seq id no:2所示。
8、优选地，所述第一外显肽包含白喉毒素毒性结构域的n-末端片段，所述第二外显肽包含白喉毒素毒性结构域的c-末端片段。
9、更优选地，所述白喉毒素毒性结构域的n-末端片段的氨基酸序列如seq id no:3所示，所述白喉毒素毒性结构域的c-末端片段的氨基酸序列如seq id no:4所示；
10、或者，所述白喉毒素毒性结构域的n-末端片段的氨基酸序列如seq id no:5所示，所述白喉毒素毒性结构域的c-末端片段的氨基酸序列如seq id no:6所示；
11、或者，所述白喉毒素毒性结构域的n-末端片段的氨基酸序列如seq id no:7所示，所述白喉毒素毒性结构域的c-末端片段的氨基酸序列如seq id no:8所示。
12、优选地，所述第一融合蛋白的氨基酸序列如seq id no:9所示，所述第二融合蛋白的氨基酸序列如seq id no:10所示；
13、或者，所述第一融合蛋白的氨基酸序列如seq id no:11所示，所述第二融合蛋白的氨基酸序列如seq id no:12所示；
14、或者，所述第一融合蛋白的氨基酸序列如seq id no:13所示，所述第二融合蛋白的氨基酸序列如seq id no:14所示。
15、本专利技术的第二方面提供了一种重组载体对，其包括第一重组载体和第二重组载体，所述第一重组载体包含编码第一方面所述第一融合蛋白的核酸序列，所述第二重组载体包含编码第一方面所述第二融合蛋白的核酸序列。
16、优选地，所述第一重组载体还包含编码egfp-p2a的核酸序列，所述第二重组载体还包含编码p2a-mcherry的核酸序列。
17、本专利技术的第三方面提供了一种表达系统，所述表达系统包括本专利技术第一方面所述融合蛋白组合物或本专利技术第二方面所述重组载体对。
18、本专利技术的第四方面提供了一种包含本专利技术第一方面所述融合蛋白组合物、本专利技术第二方面所述重组载体对或本专利技术第三方面所述表达系统中一种或多种的组合物。
19、优选地，所述组合本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种融合蛋白组合物，所述融合蛋白组合物包括第一融合蛋白和第二融合蛋白，所述第一融合蛋白包含第一分裂内含肽和第一外显肽，所述第二融合蛋白包含第二分裂内含肽和第二外显肽；
2.如权利要求1所述的融合蛋白组合物，所述第一分裂内含肽是N-内含肽，所述N-内含肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
3.如权利要求1所述的融合蛋白组合物，所述第一外显肽包含白喉毒素毒性结构域的N-末端片段，所述第二外显肽包含白喉毒素毒性结构域的C-末端片段。
4.如权利要求3所述的融合蛋白组合物，所述白喉毒素毒性结构域的N-末端片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述白喉毒素毒性结构域的C-末端片段的氨基酸序列如SEQID NO:4所示；
5.如权利要求1所述的融合蛋白组合物，其特征在于，所述第一融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述第二融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；
6.一种重组载体对，其包括第一重组载体和第二重组载体，所述第一重组载体包含编码权利要求1所述第一融合蛋白的核酸序列，所述第二重
7.如权利要求6所述的重组载体对，所述第一重组载体还包含编码EGFP-P2A的核酸序列，所述第二重组载体还包含编码P2A-mCherry的核酸序列。
8.一种表达系统，其特征在于，所述表达系统包括权利要求1所述融合蛋白组合物或权利要求6所述重组载体对。
9.权利要求1所述融合蛋白组合物、权利要求6所述重组载体对或权利要求8所述表达系统在制备治疗癌症的药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，所述癌症包括肺癌、肝癌、结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、脑胶质瘤、宫颈癌、精原细胞瘤、睾丸淋巴瘤、乳腺癌、肾癌、皮肤鳞状细胞癌、胰腺癌、胃癌、食管癌、甲状腺癌、膀胱移行上皮癌、白血病、脑瘤、胃癌、腹膜癌、头颈癌、子宫内膜癌、雌性生殖道癌、原位癌、神经纤维瘤、骨癌、皮肤癌、胃肠道间质瘤、肥大细胞肿瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤。
11.如权利要求9所述的应用，所述应用包括分别用慢病毒包装所述第一重组载体和所述第二重组载体，形成第一慢病毒和第二慢病毒；用所述第一慢病毒和所述第二慢病毒同时侵染癌细胞。
...【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白组合物，所述融合蛋白组合物包括第一融合蛋白和第二融合蛋白，所述第一融合蛋白包含第一分裂内含肽和第一外显肽，所述第二融合蛋白包含第二分裂内含肽和第二外显肽；
2.如权利要求1所述的融合蛋白组合物，所述第一分裂内含肽是n-内含肽，所述n-内含肽的氨基酸序列如seq id no:1所示；
3.如权利要求1所述的融合蛋白组合物，所述第一外显肽包含白喉毒素毒性结构域的n-末端片段，所述第二外显肽包含白喉毒素毒性结构域的c-末端片段。
4.如权利要求3所述的融合蛋白组合物，所述白喉毒素毒性结构域的n-末端片段的氨基酸序列如seq id no:3所示，所述白喉毒素毒性结构域的c-末端片段的氨基酸序列如seqid no:4所示；
5.如权利要求1所述的融合蛋白组合物，其特征在于，所述第一融合蛋白的氨基酸序列如seq id no:9所示，所述第二融合蛋白的氨基酸序列如seq id no:10所示；
6.一种重组载体对，其包括第一重组载体和第二重组载体，所述第一重组载体包含编码权利要求1所述第一融合蛋白的核酸序列，所述第二重组载体...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘馨德，张博洋，关淑文，李天顺，顾雨春，吴理达，
申请(专利权)人：呈诺再生医学科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：
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