细胞冻存液、细胞冻存和复苏方法及其应用技术

本发明专利技术涉及用于提取核酸的细胞冻存液及其制备方法和应用。本发明专利技术的细胞冻存液包括胎牛血清、DMSO、ROCK1抑制剂、pMEK抑制剂和GSK

【技术实现步骤摘要】
细胞冻存液、细胞冻存和复苏方法及其应用


[0001]本专利技术属于细胞生物学
，具体涉及一种细胞冻存液、一种细胞冻存和复苏方法及其应用。

技术介绍

[0002]胚胎干细胞是早期胚胎分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。胚胎干细胞的各种生物特性随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化，因此制备过程中需要进行有效的冻存。冻存细胞时，细胞内外环境中的水会形成冰晶，导致细胞内发生一系列的理化变化，如机械损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、pH值改变以及蛋白质变性等，严重时甚至会导致细胞死亡。因此，冻存液的优劣对冻存后细胞的质量有着举足轻重的影响。
[0003]对基因编辑胚胎干细胞进行筛选有时仅能获得数十个细胞，采用常规的细胞冻存方式往往操作繁琐且细胞复苏活率较低，因此，亟需一种针对基因编辑胚胎干细胞的高效的细胞冻存液。
[0004]此外，针对基因编辑胚胎干细胞，过程中会产生大批量亟需鉴定的胚胎干细胞克隆，鉴定时间窗口短，若不能得知阳性克隆则需要对所有待鉴定克隆进行细胞传代操作，工作量极大且耗费巨大。若能在鉴定工作明确前将小鼠胚胎干细胞冻存，这将极大的拓宽鉴定所需的时间窗口。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术对96孔板直接冻存复苏胚胎干细胞的操作步骤进行优化，且对冻存液进行优化。为此，本专利技术提供了一种细胞冻存液和一种细胞冻存复苏方法。本专利技术提供的细胞冻存液可极大提高96孔板冻存复苏效率，极大拓宽可操作空间，对于基因编辑等待基因型鉴定结果，或者药物筛选等待筛选结果再传代等都具有重要的作用。此外，本专利技术的细胞冻存液可以进行批量冻存复苏，操作简单；同时保持了细胞高复苏活率，不影响细胞的特性，有助于细胞冻存技术的快速应用和推广。
[0006]为了实现本专利技术的目的，采用如下技术方案。
[0007]在第一方面，本专利技术提供了一种细胞冻存液，其包括胎牛血清、DMSO、ROCK抑制剂、pMEK抑制剂和GSK
‑
3抑制剂。
[0008]在一些实施方式中，所述ROCK抑制剂选自Y
‑
27632和H
‑
1152中的至少一种，优选为Y
‑
27632。
[0009]在一些实施方式中，所述pMEK抑制剂选自PD0325901、PD98059、U0126和ARRY
‑
142886中的至少一种，优选为PD0325901。
[0010]在一些实施方式中，所述GSK
‑
3抑制剂选自Chir99021、Chir
‑
98014和SB216763中的至少一种，优选为Chir99021。
[0011]在一些实施方式中，所述细胞冻存液包括：80
‑
95v/v％胎牛血清；5
‑
20v/v％DMSO；
0.2
‑
5μM ROCK抑制剂；0.2
‑
5μM pMEK抑制剂；和0.2
‑
5μM GSK
‑
3抑制剂。
[0012]在一些实施方式中，所述细胞冻存液中，胎牛血清的体积百分含量可以为80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、95％以及它们之间的任意值。
[0013]在一些实施方式中，所述细胞冻存液中，DMSO的体积百分含量可以为5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％、20％以及它们之间的任意值。
[0014]在一些实施方式中，所述细胞冻存液中，ROCK抑制剂的浓度可以为0.2μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM以及它们之间的任意值。
[0015]在一些实施方式中，所述细胞冻存液中，pMEK抑制剂的浓度可以为0.2μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM以及它们之间的任意值。
[0016]在一些实施方式中，所述细胞冻存液中，GSK
‑
3抑制剂的浓度可以为0.2μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM以及它们之间的任意值。
[0017]在一些实施方式中，所述细胞冻存液包括：85
‑
95v/v％胎牛血清；5
‑
15v/v％DMSO；0.5
‑
2μM ROCK抑制剂；0.5
‑
2μM pMEK抑制剂；和0.5
‑
2μM GSK
‑
3抑制剂。
[0018]在一些实施方式中，所述细胞冻存液包括90v/v％胎牛血清、10v/v％DMSO、1μM Y27632、1μM pD0325901和1μM Chir99021。
[0019]在第二方面，本专利技术提供了一种细胞冻存和复苏的方法，包括将细胞与第一方面所述的细胞冻存液混合的步骤。
[0020]在一些实施方式中，所述方法包括将培养在96孔板中的细胞与所述细胞冻存液混合，并进行冷冻保存。
[0021]在一些实施方式中，所述方法还包括将在96孔板中冷冻保存的细胞解冻，进行复苏。
[0022]在一些实施方式中，所述冷冻保存的温度为
‑
75℃至
‑
85℃。在一些实施方案中，所述冷冻保存的温度为
‑
80℃。
[0023]在一些实施方式中，所述解冻在35℃至40℃的温度下进行。在一些实施方式中，所述解冻在37℃的温度下进行。在一些实施方式中，所述解冻在水浴锅中进行。
[0024]在一些实施方式中，所述细胞为胚胎干细胞。在一些实施方式中，所述细胞为哺乳动物的胚胎干细胞。在一些实施方式中，所述细胞为经基因编辑的哺乳动物胚胎干细胞。
[0025]在一些实施方式中，所述细胞为杂交瘤细胞。
[0026]在一些实施方式中，所述方法包括96孔板的冷冻和96孔板的复苏。在一些实施方式中，96孔板的冷冻包括以下步骤：(1)将96孔板中的细胞培养基上清弃掉；(2)将培养在96孔板中的细胞与所述细胞冻存液混合，密封，在
‑
80℃下进行冷冻保存。在一些实施方式中，所述96孔板的复苏包括以下步骤：(3)将冷冻保存的96孔板在35
‑
40℃水浴锅中摇晃解冻，直至冻存液完全化开；(4)弃去冻存液，加入培养基以使细胞适应培养环境；(5)弃去培养基，用PBS洗涤，用Accutase在35
‑
40℃消化5
‑
10min，随后加入培养基终止消化。
[0027]在第三方面，本专利技术提供了根据第一方面所述的细胞冻存液或根据第二方面所述的方法在杂交瘤细胞筛选或在经基因编辑的胚胎干细胞筛选中的应用。相比于现有技术，本专利技术提供的细胞冻存液特别适用于ESC细胞冻存，可以在ESC基因编辑细胞筛选过程中，在96孔板内，每个孔的细胞数量较少时即对其进行冻存，并且可以进行批量冻存复苏，操本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞冻存液，包括胎牛血清、DMSO、ROCK抑制剂、pMEK抑制剂和GSK
‑
3抑制剂。2.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述ROCK抑制剂选自Y
‑
27632和H
‑
1152中的至少一种，优选为Y
‑
27632；和/或所述pMEK抑制剂选自PD0325901、PD98059、U0126和ARRY
‑
142886中的至少一种，优选为PD0325901；和/或所述GSK
‑
3抑制剂选自Chir99021、Chir
‑
98014和SB216763中的至少一种，优选为Chir99021。3.根据权利要求1或2所述的细胞冻存液，其特征在于，所述细胞冻存液包括：4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的细胞冻存液，其特征在于，所述细胞冻存液包括：5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的细胞冻存液，其特征在于，所述细胞冻存液包括90v/v...

【专利技术属性】
技术研发人员：林慧婷，
申请(专利权)人：广州明迅生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：