维持细胞活性的保存液及其制备方法和保存细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种维持细胞活性的保存液，保存液包括以下成分：NaCl1～110mM、KH2PO41～10mM、CaCl20.1～10mM、MgSO40.1～1mM、NaHCO31～100mM、海藻糖1～50mg/ml、蔗糖0.1～10mg/ml、甘油0.01～0.5mM、谷氨酸0.03～10mM、L

【技术实现步骤摘要】
维持细胞活性的保存液及其制备方法和保存细胞的方法


[0001]本专利技术涉及细胞保存
，尤其涉及一种维持细胞活性的保存液及其制备方法和保存细胞的方法。

技术介绍

[0002]细胞在生命科学研究、药物筛选、组织器官修复和疾病治疗等各领域有着极其重要的用途，尤其是近年来细胞治疗技术发展迅猛，具有广阔的应用前景，但是由于细胞在应用前需要进行适当的处理，这些操作要求在GMP环境下由专业的技术人员完成，在环境上、技术上和时间上均有较高要求，且每一个处理步骤都有可能影响到细胞性能，从而导致细胞的质量控制工作难以统一标准，因此阻碍了细胞在科研、工业和临床的应用。
[0003]目前细胞的运输和暂时储存主要采取两种方式：冷冻状态液氮运输和培养状态下装满培养基常温运输。两种方式都存在不便之处，其中，液氮运输需先使用细胞冻存液冷冻细胞，冻存液的成分复杂、冻存后细胞活性下降、复苏操作要求高、复苏时间长和造价高等使其后续应用受到了影响。而常温运输装满培养基的方式，保存过程中细胞代谢产物会对细胞的保存有一定影响，细胞大量增殖使生长受限、细胞易成团堆集等问题导致了常温保存下细胞的存活时间短，且贴壁细胞使用前需在特定条件下由专业人员消化细胞，因此制约了其应用。
[0004]目前所使用的运输方式多是低温(2
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8℃)运送，大多数细胞保存液含有异种动物蛋白、人血清或激素等，导致应用过程中会有不安全的因素存在。此外细胞保存时间短、长时间保存后细胞活性差、保存液使用方法不便利等都是亟需解决的问题。
[0005]现有技术1为中国专利CN 107372464 A公开了一种维持间充质干细胞活性的运输保存液与制备方法，该保存液由溶液介质和细胞活力保护剂组成；其中溶液介质为复方电解质注射液，添加终浓度为0.05g/ml人血白蛋白；细胞活力保护剂包括复方氨基酸、褪黑激素和雷帕霉素，添加终浓度分别为0.4～1.6mg/ml、0.23～2.3μg/ml、20～200nM。现有技术1的运输保存液保存间充质干细胞，24小时后细胞活率为91.93％，但由于人血清白蛋白容易使细胞成团，阻止细胞贴壁，因此其48小时及以上长时间保存后的细胞活率较低，成团率较高。
[0006]现有技术2为中国专利CN 106538513 A公开了一种人间充质干细胞保存运输液，包含1
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15mg/ml氯化钠、1
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15mg/ml葡萄糖酸钠、1
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10mg/ml醋酸钠、0.1
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9.9v/v％人AB血清、0.1
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25mg/ml人参皂苷Rb1、1
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100ng/ml转铁蛋白、1
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100ng/ml还原型谷胱苷肽、0.01
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1mmol/l谷氨酰胺，保存24h后，人AB血清2
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5v/v％浓度下细胞的贴壁率高，转铁蛋白、还原型谷胱苷肽和人参皂苷Rb1的添加能提高细胞活性，有利于保持细胞正常代谢活力。现有技术2由于保护剂的作用有限，活力维持时间较短，导致其48小时及以上长时间保存后的细胞活率较低，并且细胞从保存运输液中取出后要离心去保存液，使用麻烦。

技术实现思路

[0007]本专利技术所要解决的第一个技术问题在于，提供一种维持细胞活性的保存液，无动物源成分、无血液制品成分，辅料安全性高，长时间运输后仍能高度维持细胞的活性，细胞存活率高、细胞增殖快、细胞功能不受影响。
[0008]本专利技术所要解决的第二个技术问题在于，提供一种保存液的制备方法，操作简单，配制方便。
[0009]本专利技术所要解决的第三个技术问题在于，提供一种保存液保存细胞的方法，保存后的细胞可直接重悬应用，且适用范围广。
[0010]为达到上述技术效果，本专利技术提供了一种维持细胞活性的保存液，其包括以下成分：
[0011]无机盐缓冲液3～250mM、海藻糖1～50mg/ml、氨基酸混合液2～120mM、左旋肉碱0.01～1mM、氯化胆碱0.01～1mM和硫胺素焦磷酸0.1～100nM。
[0012]作为上述技术方案的改进，所述无机盐缓冲液选用NaCl、KH2PO4、CaCl2、MgSO4和NaHCO3中的一种或多种；
[0013]所述氨基酸混合液选用谷氨酸、L
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谷氨酰胺和L
‑
天冬氨酸中的一种或多种。
[0014]作为上述技术方案的改进，所述保存液包括以下成分：
[0015]NaCl 1～110mM、KH2PO
4 1～10mM、CaCl
2 0.1～10mM、MgSO
4 0.1～1mM、NaHCO
3 1～100mM、海藻糖1～50mg/ml、蔗糖0.1～10mg/ml、甘油0.01～0.5mM、谷氨酸0.03～10mM、L
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谷氨酰胺1～100mM、L
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天冬氨酸1～10mM、左旋肉碱0.01～1mM、氯化胆碱0.01～1mM、硫胺素焦磷酸1～100nM。
[0016]作为上述技术方案的改进，所述保存液包括以下成分：
[0017]NaCl 10～30mM、KH2PO
4 2～8mM、CaCl
2 0.1～5mM、MgSO
4 0.3～0.6mM、NaHCO
3 10～30mM、海藻糖10～40mg/ml、蔗糖0.1～2mg/ml、甘油0.01～0.3mM、谷氨酸0.03～1mM、L
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谷氨酰胺1～20mM、L
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天冬氨酸2～5mM、左旋肉碱0.04～0.06mM、氯化胆碱0.04～0.06mM、硫胺素焦磷酸20～50nM。
[0018]作为上述技术方案的改进，所述保存液包括以下成分：
[0019]NaCl 12.7mM、KH2PO
4 5mM、CaCl
2 1.25mM、MgSO
4 0.45mM、NaHCO
3 25mM、海藻糖20mg/ml、蔗糖0.8mg/ml、甘油0.11mM、谷氨酸0.3mM、L
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谷氨酰胺12mM、L
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天冬氨酸4.4mM、左旋肉碱0.05mM、氯化胆碱0.05mM、硫胺素焦磷酸40nM。
[0020]相应的，本专利技术还提供了一种制备权利上述保存液的方法，包括如下步骤：
[0021](1)按浓度称取各成分并使用超纯水充分溶解，得到混合溶液；
[0022](2)将混合溶液在无菌条件下过滤，得到细胞保存液。
[0023]作为上述技术方案的改进，所述步骤(2)包括：
[0024]用0.3
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0.5μm的过滤膜对混合溶液进行第一次过滤处理；
[0025]用0.15
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0.25μm的过滤膜对混合溶液进行第二次过滤处理，得到细胞保存液。
[0026]相应的，本专利技术还提供了一种利用上述保存液保存细胞的方法，包括如下步骤：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种维持细胞活性的保存液，其特征在于：所述保存液包括以下成分：无机盐缓冲液3～250mM、海藻糖1～50mg/ml、氨基酸混合液2～120mM、左旋肉碱0.01～1mM、氯化胆碱0.01～1mM和硫胺素焦磷酸0.1～100nM。2.如权利要求1所述的维持细胞活性的保存液，其特征在于：所述无机盐缓冲液选用NaCl、KH2PO4、CaCl2、MgSO4和NaHCO3中的一种或多种；所述氨基酸混合液选用谷氨酸、L
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谷氨酰胺和L
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天冬氨酸中的一种或多种。3.如权利要求1或2所述的维持细胞活性的保存液，其特征在于：所述保存液包括以下成分：NaCl 1～110mM、KH2PO
4 1～10mM、CaCl
2 0.1～10mM、MgSO
4 0.1～1mM、NaHCO
3 1～100mM、海藻糖1～50mg/ml、蔗糖0.1～10mg/ml、甘油0.01～0.5mM、谷氨酸0.03～10mM、L
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谷氨酰胺1～100mM、L
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天冬氨酸1～10mM、左旋肉碱0.01～1mM、氯化胆碱0.01～1mM、硫胺素焦磷酸1～100nM。4.如权利要求3所述的维持细胞活性的保存液，其特征在于：所述保存液包括以下成分：NaCl 10～30mM、KH2PO
4 2～8mM、CaCl
2 0.1～5mM、MgSO
4 0.3～0.6mM、NaHCO
3 10～30mM、海藻糖10～40mg/ml、蔗糖0.1～2mg/ml、甘油0.01～0.3mM、谷氨酸0.03～1mM、L
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谷氨酰胺1～20mM、L
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天冬氨酸2～5mM、左旋肉碱0.04～0.06mM、氯化胆碱0.04～0.06mM、硫胺素焦磷酸20～50nM。5.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：江涛，彭特，余玉英，
申请(专利权)人：广东崖山生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：