本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种M13 mp18噬菌体单链DNA的制备方法。该方法包括：培养宿主菌至OD值为10~20，按照MOI 0.1~10接入M13噬菌体进行发酵培养；将共培养的培养物离心，取上清液超滤换液后进行聚乙二醇沉淀；将沉淀物裂解、纯化，获得M13 mp18噬菌体单链DNA。该方法大大提升了M13噬菌体单链DNA的表达水平，弥补了现有技术M13噬菌体单链DNA的表达水平低的缺点。本发明专利技术降低了M13噬菌体单链DNA生产成本，提高了M13噬菌体单链DNA的经济效益，为其在DNA纳米折纸载体的推广应用奠定基础，对规模化制备DNA纳米折纸载体、提高经济效益具有重要意义。济效益具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
一种M13噬菌体单链DNA的制备方法
[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种M13噬菌体单链DNA的制备方法。
技术介绍
[0002]DNA折纸术（DNA origami）是DNA纳米技术的一个重要分支。该方法专利技术于2006年(Nature 2006)，即利用上百条短单链DNA作为“订书钉”，辅助折叠一条长达数千碱基的噬菌体基因组单链DNA（又称脚手架链），并自组装形成预先设计的结构。其中M13噬菌体所携带的单链DNA为最常用的脚手架链之一。M13噬菌体是一种丝状噬菌体，内有一个环状单链DNA分子，含DNA复制和噬菌体增殖所需的遗传信息。其中M13mp系列对野生型M13加以改造，插入了多克隆位点和LacZ基因，可容纳外源DNA300
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400bp，可用于制备DNA测序时用的单链模板和核酸探针。
[0003]M13噬菌体颗粒是丝状的，只感染F+（含F质粒，能产生性菌毛）的大肠杆菌。感染宿主后通常不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。
[0004]现有技术制备M13噬菌体单链DNA时，主要采用聚乙二醇法沉淀M13病毒颗粒，然后利用乙醇沉淀法、苯酚抽提法等有机试剂提取M13 单链DNA，在表达方面，无法通过设备线性放大从而产业化且表达水平较低；在提取方面，通常需要大量使用有机试剂且常常需要
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20℃预冷，增加了对生产车间在环保、防爆等方面的需求，使得工业放大成本和风险大增。
技术实现思路
[0005]有鉴于此，本专利技术提供了一种M13噬菌体单链DNA的制备方法。该方法大大提高了M13噬菌体单链DNA的产率，降低了ssDNA的生产成本，适于规模化制备DNA纳米折纸载体，有效地提高了经济效益。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种M13 噬菌体单链DNA的制备方法，包括：培养宿主菌至OD值为10~20，按照MOI 0.1~10接入M13噬菌体进行发酵培养；将共培养的培养物离心，取上清液超滤换液后进行聚乙二醇沉淀；将沉淀物裂解、纯化，获得M13噬菌体单链DNA。
[0007]本专利技术中，对M13噬菌体的具体种类没有特殊限定，本领域常见的M13噬菌体均可。在具体实施例中，具体为M13mp18噬菌体。
[0008]本专利技术中，所述宿主菌为大肠杆菌，在具体实施例中具体为JM109菌株。
[0009]一些具体实施例中，所述培养宿主菌至OD值为15，接入M13噬菌体。
[0010]一些具体实施例中，所述MOI 为0.1。
[0011]本专利技术中，所述发酵培养的培养基为含有5~15mM Mg
2+
和 10~15mM Ca
2+
的 2
×
YT培养基。
[0012]一些具体实施例中，所述发酵培养的培养基为含有15mM Mg
2+
和 15mM Ca
2+
的 2
×
YT培养基。
[0013]本专利技术中，所述发酵培养的条件为：温度37℃，pH值7.00，搅拌速率150~650rpm，溶氧值DO20~30%；发酵培养的时间为4h~5h。
[0014]本专利技术中，所述聚乙二醇沉淀包括：取上清液超滤换液后，加入聚乙二醇和NaCl，使聚乙二醇终浓度为4wt%
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10wt%，NaCl终浓度为0.5mmol/L，静置、离心；所述裂解采用碱进行裂解；所述纯化为柱层析纯化，采用的纯化柱为为SephacrylS
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500HR、Sepharose6FF或CaptoCore700，优选为CaptoCore700；将共培养的培养物离心，取上清液超滤换液后进行聚乙二醇沉淀；将沉淀物裂解、纯化。
[0015]本专利技术提供一种M13噬菌体单链DNA的制备方法，包括：培养宿主菌至OD值为10~20，按照MOI0.1~10接入M13噬菌体进行发酵培养；将共培养的培养物离心，取上清液超滤换液后进行聚乙二醇沉淀；将沉淀物裂解、纯化，获得M13mp18噬菌体单链DNA。该方法大大提升了M13噬菌体单链DNA的表达水平，弥补了现有技术M13噬菌体单链DNA的表达水平低的缺点。本专利技术降低了M13噬菌体单链DNA生产成本，提高了M13噬菌体单链DNA的经济效益，为其在DNA纳米折纸载体的推广应用奠定基础，对规模化制备DNA纳米折纸载体、提高经济效益具有重要意义。
附图说明
[0016]图1示不同侵染时机对噬菌体生长的影响；图2示不同侵染复数（MOI）对噬菌体生长的影响；图3示不同补料条件对噬菌体生长的影响；图4示CaptoCore700柱层析纯化后的色谱图。
具体实施方式
[0017]本专利技术提供了一种M13噬菌体单链DNA的制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。
[0018]如无特殊说明，本专利技术采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0019]下面结合实施例，进一步阐述本专利技术：实施例1M13mp18噬菌体和宿主菌共发酵的发酵参数的优化
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侵染时机1目的：比较不同侵染时机对噬菌体在5L生物反应器上生长情况的影响，并确定最优侵染时机。
[0020]2材料与方法2.1培养基2
×
YT培养基：大豆蛋白胨1.6%、酵母提取物1%、NaCl0.5%，pH7.0。
[0021]2.2实验仪器2.2.1恒温摇床：上海一恒THI
‑
300C
2.2.2 超净工作台：苏净安泰SW
‑
CJ
‑
2FD2.2.3 pH计：梅特勒FE28+LE4382.2.4 超微量光度计：Denovix DS
‑
11+2.2.5 电子天平秤：上海越平3
‑
0.012.2.6 高压灭菌锅：上海博迅YXQ
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100A2.2.7 5L发酵罐：上海高机B1OF
‑
6005B1G2.3试验菌株2.3.1 宿主菌：大肠杆菌JM109 Escherichia coli (Migula) Castellani and Chalmers，购自于美国菌种保藏中心（ATCC），编号为53323，储存人为Crop Genetics International N.V.，基因型为F' traD36 proA+ proB+ lacIq delta(lacZ)M15 delta(lac
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proAB) supE44 hsdR17 recA1 gyrA96 thi
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1 endA1 relA1 e1本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种M13 噬菌体单链DNA的制备方法，其特征在于，包括：培养宿主菌至OD值为10~20，按照MOI 0.1~10接入M13噬菌体进行发酵培养；将共培养的培养物离心，取上清液超滤换液后进行聚乙二醇沉淀；将沉淀物裂解、纯化，获得M13噬菌体单链DNA。2.根据权利要求1所述的制备方方法，其特征在于，所述M13噬菌体为M13mp18噬菌体。3.根据权利要求1所述的制备方方法，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌为JM109菌株。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述培养宿主菌至OD值为15，接入M13噬菌体。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述MOI 为0.1。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的培养基为含有5~15mM Mg
2+
和 10~15mM Ca
2+
的 2
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YT培养基。...
【专利技术属性】
技术研发人员：李辰，
申请(专利权)人：北京君全智药生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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