用于通过测序对单细胞进行空间映射的条形码化的孔制造技术

本文的公开内容包括用于将测序数据分配到分区的方法的系统、方法、组合物和试剂盒。在一些实施方案中，提供了将单细胞的测序数据和表型数据关联的方法。一些实施方案提供了减少测序数据中的噪声的方法。本文的公开内容包括包含分区索引序列的分区索引寡核苷酸。分区索引寡核苷酸可以与分区关联。位于同一分区内的分区索引寡核苷酸可以包含相同的分区索引序列。位于不同分区内的分区索引寡核苷酸包含不同的分区索引序列。同的分区索引序列。同的分区索引序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于通过测序对单细胞进行空间映射的条形码化的孔
[0001]相关申请
[0002]本申请根据35 U.S.C.
§
119(e)要求2020年1月29日提交的美国临时专利申请序列第62/967483号的权益，此相关申请的内容为了所有目的通过引用以其整体并入本文。
[0003]背景
[0004]领域
[0005]本公开内容总体上涉及分子生物学领域，例如使用分子条形码化(molecular barcoding)确定基因表达。
[0006]对相关技术的描述
[0007]当前的技术允许在每个细胞与条形码化试剂珠在隔室(compartment)中共定位时通过将细胞特异性寡核苷酸条形码附接至来自个体细胞的多(A)mRNA分子而以大规模并行的方式(例如，>10000个细胞)测量单细胞的基因表达。然而，当确定单细胞的表达谱时，两个细胞可以被识别为一个细胞，并且两个细胞的表达谱可以被识别为一个细胞的表达谱(例如，双重体(doublet)表达谱)。多重体(multiplet)表达谱(例如，源自与条形码化试剂珠在隔室中共定本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种将测序数据分配到分区的方法，所述方法包括：提供多于一个分区，所述多于一个分区各自包含多于一种分区索引寡核苷酸，其中所述分区索引寡核苷酸各自包含预定的分区索引序列，其中位于同一分区内的分区索引寡核苷酸包含相同的分区索引序列，并且其中位于不同分区内的分区索引寡核苷酸包含不同的分区索引序列；将多于一个固体支持物和多于一个单细胞分区到所述多于一个分区，其中所述单细胞各自包含核酸靶的拷贝，其中所述多于一个固体支持物各自包含多于一种寡核苷酸条形码，所述多于一种寡核苷酸条形码各自包含细胞标记序列，其中与同一固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含相同的细胞标记序列，并且其中与不同固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含不同的细胞标记序列；使用所述多于一种寡核苷酸条形码对所述分区索引寡核苷酸进行条形码化以产生多于一种条形码化分区索引寡核苷酸；使用所述多于一种寡核苷酸条形码对来自所述多于一个单细胞中的至少一个的核酸靶的拷贝进行条形码化以产生多于一种条形码化核酸靶；获得测序数据，所述测序数据包括所述条形码化分区索引寡核苷酸或其产物和所述多于一种条形码化核酸靶或其产物的多于一个测序读段；鉴定所述测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列；以及基于所述测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列，将所述多于一个测序读段中的每一个分配到所述多于一个分区中的分区。2.一种将单细胞的测序数据和表型数据关联的方法，所述方法包括：获得多于一个单细胞的表型数据，其中所述单细胞各自包含核酸靶的拷贝；提供多于一个分区，所述多于一个分区各自包含多于一种分区索引寡核苷酸，其中所述分区索引寡核苷酸各自包含预定的分区索引序列，其中位于同一分区内的分区索引寡核苷酸包含相同的分区索引序列，并且其中位于不同分区内的分区索引寡核苷酸包含不同的分区索引序列；将所述多于一个单细胞中的每一个分区到所述多于一个分区中的经鉴定的分区；使用与固体支持物关联的多于一种寡核苷酸条形码对来自所述多于一个单细胞中的至少一个的核酸靶的拷贝进行条形码化以产生多于一种条形码化核酸靶；使用与固体支持物关联的多于一种寡核苷酸条形码对所述分区索引寡核苷酸进行条形码化以产生多于一种条形码化分区索引寡核苷酸；获得所述多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物和所述多于一种条形码化核酸靶或其产物的测序数据；以及基于所述测序数据中所述多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物中的至少一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物的分区索引序列，将所述多于一个单细胞中的至少一个细胞的测序数据与表型数据关联。3.根据权利要求2所述的方法，所述方法包括将多于一个固体支持物分区到所述多于一个分区，其中所述多于一个固体支持物各自包含多于一种寡核苷酸条形码，所述多于一种寡核苷酸条形码各自包含第一分子标记序列和细胞标记序列，其中与同一固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含相同的细胞标记序列，并且其中与不同固体支持物关联的寡核苷
酸条形码包含不同的细胞标记序列。4.一种减少测序数据中的噪声的方法，所述方法包括：提供多于一个分区，所述多于一个分区各自包含多于一种分区索引寡核苷酸，其中所述分区索引寡核苷酸各自包含预定的分区索引序列，其中位于同一分区内的分区索引寡核苷酸包含相同的分区索引序列，并且其中位于不同分区内的分区索引寡核苷酸包含不同的分区索引序列；将多于一个固体支持物和多于一个单细胞分区到所述多于一个分区，其中所述单细胞各自包含核酸靶的拷贝，其中所述多于一个固体支持物各自包含多于一种寡核苷酸条形码，所述多于一种寡核苷酸条形码各自包含细胞标记序列，其中与同一固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含相同的细胞标记序列，并且其中与不同固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含不同的细胞标记序列；获得所述多于一个分区的成像数据以鉴定一个或更多个噪声分区，其中所述噪声分区是：(i)不包含细胞的分区，(ii)包含多于一个固体支持物的分区，和/或(iii)包含多于一个细胞的分区；使用所述多于一种寡核苷酸条形码对所述分区索引寡核苷酸进行条形码化以产生多于一种条形码化分区索引寡核苷酸；使用所述多于一种寡核苷酸条形码对来自所述多于一个单细胞中的至少一个的核酸靶的拷贝进行条形码化以产生多于一种条形码化核酸靶；获得所述多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物和所述多于一种条形码化核酸靶或其产物的测序数据；鉴定所述测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列；以及从获得的所述测序数据中去除与各自与噪声分区的分区索引序列关联的一种或更多种细胞标记序列关联的测序数据。5.根据权利要求1
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3中任一项所述的方法，所述方法包括：获得所述多于一个分区的成像数据以鉴定一个或更多个噪声分区，其中所述噪声分区是：(i)不包含细胞的分区，(ii)包含多于一个固体支持物的分区，和/或(iii)包含多于一个细胞的分区；鉴定所述测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列；以及从获得的所述测序数据中去除与各自与噪声分区的分区索引序列关联的一种或更多种细胞标记序列关联的测序数据。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的方法，其中所述测序数据包括所述条形码化分区索引寡核苷酸或其产物和所述多于一种条形码化核酸靶或其产物的多于一个测序读段。7.根据权利要求6所述的方法，所述方法包括从所述测序数据去除一个或更多个噪声测序读段，其中所述噪声测序读段包括源自噪声分区的测序读段。8.根据权利要求2
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7中任一项所述的方法，所述方法包括：
鉴定所述测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列；以及基于所述测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列，将所述多于一个测序读段中的每一个分配到所述多于一个分区中的分区。9.根据权利要求1和权利要求4
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8中任一项所述的方法，所述方法包括：获得多于一个单细胞的表型数据，其中所述单细胞各自包含核酸靶的拷贝；将所述多于一个单细胞中的每一个分区到所述多于一个分区中的经鉴定的分区；以及基于所述测序数据中所述多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物中的至少一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物的分区索引序列，将所述多于一个单细胞中的至少一个细胞的测序数据与表型数据关联。10.根据权利要求1
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9中任一项所述的方法，所述方法包括对于指示所述多于一个单细胞中的单细胞的每一种独特细胞标记序列：确定所述测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列，从而将多于一个单细胞中的每一个细胞的测序数据和表型数据关联。11.根据权利要求1
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10中任一项所述的方法，其中所述多于一种条形码化核酸靶各自包含与所述核酸靶的至少一部分互补的序列和所述第一分子标记。12.根据权利要求1
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11中任一项所述的方法，其中所述多于一种条形码化分区索引寡核苷酸各自包含与所述分区索引序列的至少一部分互补的序列和所述第一分子标记。13.根据权利要求1
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12中任一项所述的方法，其中获得所述多于一种条形码化分区索引寡核苷酸的测序数据包括获得所述分区索引序列的至少一部分。14.根据权利要求1
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13中任一项所述的方法，其中所述多于一个测序读段中的每一个包含(1)细胞标记序列和(2)第一分子标记序列。15.根据权利要求1
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14中任一项所述的方法，其中所述多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物的多于一个测序读段中的每一个包含所述分区索引序列的至少一部分。16.根据权利要求1
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15中任一项所述的方法，其中所述分区是孔或液滴。17.根据权利要求1
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16中任一项所述的方法，其中每一种寡核苷酸条形码包含第一通用序列。18.根据权利要求1
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17中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸条形码包含含有捕获序列的靶结合区，任选地所述靶结合区包含基因特异性序列、寡(dT)序列、随机多聚体或其任何组合。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述分区索引寡核苷酸包含与所述捕获序列互补的序列，所述捕获序列被配置成捕获所述分区索引寡核苷酸，任选地与所述捕获序列互补的序列包含多(dA)区。20.根据权利要求2
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3和5
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19中任一项所述的方法，将所述多于一个单细胞中的每一个分区到所述多于一个分区中的经鉴定的分区包括索引分选。21.根据权利要求2
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3和5
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20中任一项所述的方法，将所述多于一个单细胞中的每一个分区到所述多于一个分区中的经鉴定的分区包括将所述多于一个单细胞引入微孔阵列的微孔中。22.根据权利要求1和权利要求4
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21所述的方法，其中将多于一个固体支持物和多于一个单细胞分区到所述多于一个分区包括索引分选。
23.根据权利要求1和权利要求4
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22所述的方法，其中将多于一个固体支持物和多于一个单细胞分区到所述多于一个分区包括将所述多于一个单细胞引入微孔阵列的微孔中。24.根据权利要求21
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23中任一项所述的方法，其中将所述多于一个单细胞引入微孔阵列的微孔中包括将所述多于一个单细胞引入所述微孔阵列在多于一个经鉴定的微孔处的微孔中。25.根据权利要求21
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24中任一项所述的方法，其中将所述多于一个单细胞引入微孔阵列的微孔中包括使所述多于一个单细胞通过流式细胞术沉积到所述微孔阵列的经鉴定的微孔中。26.根据权利要求25所述的方法，其中使所述多于一个单细胞通过流式细胞术沉积到所述微孔阵列的经鉴定的微孔中包括使用流式细胞仪一次使一个单细胞沉积到所述微孔阵列的经鉴定的微孔中。27.根据权利要求21
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26中任一项所述的方法，所述方法还包括使流式细胞仪的分选组件与所述微孔阵列对齐。28.根据权利要求2
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27中任一项所述的方法，其中所述表型数据包括事件数据并且任选地所述事件数据包括源自分选装置的定量生物事件数据。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述事件数据包括侧向散射信号、前向散射信号、一个或更多个荧光信号或其任何组合。30.根据权利要求2
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29中任一项的方法，所述方法包括对所述单细胞的表型数据和测序数据进行相关性分析。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述相关性分析鉴定以下中的一种或更多种：候选生物标志物、候选治疗剂、治疗剂的候选剂量和/或候选治疗剂的细胞靶。32.根据权利要求1
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31中任一项所述的方法，其中所述多于一种条形码化分区索引寡核苷酸包含所述第一通用序列的互补体。33.根据权利要求1
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32中任一项所述的方法，其中所述分区索引寡核苷酸包含第二通用序列。34.根据权利要求32
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33中任一项所述的方法，其中获得所述多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物的序列数据包括：使用能够与所述第一通用序列或其互补体杂交的引物和能够与所述第二通用序列或其互补体杂交的引物，扩增所述多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物，以产生多于一种扩增的条形码化分区索引寡核苷酸；以及获得所述多于一种扩增的条形码化分区索引寡核苷酸或其产物的测序数据。35.根据权利要求1
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34中任一项所述的方法，其中获得所述序列信息包括将测序衔接子附接到所述多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物。36.根据权利要求1
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35中任一项所述的方法，其中所述多于一种分区索引寡核苷酸中的每一种包含分区接头官能团，其中所述多于一个分区中的每一个包含分区官能团，以及其中所述分区官能团和所述分区接头官能团彼此关联，任选地所述分区接头官能团和所述分区官能团单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮及其任何组合组成的组。
37.根据权利要求1
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36中任一项所述的方法，其中所述分区索引寡核苷酸通过分区接头与所述分区关联。38.根据权利要求37所述的方法，其中所述分区接头包含碳链，任选地所述碳链包含2
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30个碳原子，还任选地所述碳链包含12个碳原子，任选地所述分区接头包含5
’
氨基修饰物C12(5AmMC12)或其衍生物。39.根据权利要求1
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38中任一项所述的方法，其中所述分区索引序列的长度是6
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60个核苷酸，和/或所述分区索引寡核苷酸的长度是50
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500个核苷酸。40.根据权利要求1
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39中任一项所述的方法，其中所述分区索引寡核苷酸被(i)附接到所述微孔；(ii)共价附接到所述微孔；(iii)缀合到所述微孔；(iv)非共价附接到所述微孔；(v)配置成可通过UV光裂解、化学处理、加热、酶处理或其任何组合从所述微孔脱离；(vi)配置成不可从所述微孔脱离；或(vii)(i)
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(vi)的任何组合。41.根据权利要求1
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40中任一项所述的方法，所述方法包括裂解所述单细胞中的一个或更多个。42.根据权利要求1
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41中任一项所述的方法，其中所述分区索引寡核苷酸被配置成可从所述分区脱离，任选地所述分区索引寡核苷酸被配置成在细胞裂解期间从所述分区脱离。43.根据权利要求1
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42中任一项所述的方法，所述方法包括使所述分区索引寡核苷酸与所述分区解离，并且任选地使所述分区索引寡核苷酸与所述分区解离包括通过UV光裂解、化学处理、加热、酶处理或其任何组合使所述分区索引寡核苷酸从所述分区脱离。44.根据权利要求43所述的方法，其中(i)所述解离发生在对所述分区索引寡核苷酸进行条形码化之后；(ii)所述解离发生在对所述分区索引寡核苷酸进行条形码化之前；和/或(iii)所述解离发生在细胞裂解期间。45.根据权利要求1
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44中任一项所述的方法，其中所述分区索引寡核苷酸与所述一个或更多个细胞中任一个的基因组序列不同源，与一个物种的基因组序列同源，或其组合，并且任选地所述物种是非哺乳动物物种。46.根据权利要求1
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45中任一项所述的方法，所述方法还包括确定所述多于一个单细胞中的一个或更多个中所述核酸靶的拷贝数。47.根据权利要求46所述的方法，其中确定所述多于一个单细胞中的一个或更多个中所述核酸靶的拷贝数包括基于与所述多于一种条形码化核...

【专利技术属性】
技术研发人员：格雷琴，
申请(专利权)人：贝克顿迪金森公司，
类型：发明
国别省市：