在生物体内创制新基因的方法及应用技术

本发明专利技术涉及基因工程和生物信息学技术领域，具体而言，涉及一种在无人工DNA模板的前提下，在生物体内创制新基因的方法及应用。所述方法是通过在生物体基因组中至少两个不同的特定位置上同时产生DNA断裂，其中所述特定位置是能够分割不同基因元件或不同蛋白结构域的基因组位点，所述DNA断裂通过非同源末端连接(NHEJ)或同源修复的方式互相连接，产生所述不同基因元件或不同蛋白结构域之间不同于原始基因组序列的新组合，形成新基因。本发明专利技术新基因能够改变生物体的生长、发育、抗性、产量等性状，具有重大应用价值。具有重大应用价值。

【技术实现步骤摘要】
在生物体内创制新基因的方法及应用


[0001]本专利技术涉及基因工程和生物信息学
，具体而言，涉及一种在无人工DNA模板的前提下，在生物体内创制新基因的方法及应用。

技术介绍

[0002]一般来讲，生物体内一个完整的基因表达盒包括启动子、5
’
非编码区(5
’
UTR)、编码区(CDS)或非编码RNA区(Non
‑
coding RNA)、3
’
非编码区(3
’
UTR)、终止子等多个元件。非编码RNA在RNA水平上就能行使其生物学功能，包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA和microRNA。CDS区域包含外显子和内含子，转录出来的RNA翻译成蛋白之后，不同区段的氨基酸通常会形成不同的结构域(domain)，特异的结构域决定了蛋白的细胞内定位和功能(如核定位信号、叶绿体导肽、线粒体导肽、DNA结合结构域、转录激活结构域、酶催化中心等)。对于非编码RNA来讲，不同的区段也具有不同的功能。当基因的一个或几个元件发生变化，就会形成一个新的基因，可能产本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在生物体内创制新基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在生物体基因组中至少两个不同的特定位置上同时产生DNA断裂，其中所述特定位置是能够分割不同基因元件或不同蛋白结构域的基因组位点，所述DNA断裂通过非同源末端连接(NHEJ)或同源修复的方式互相连接，产生所述不同基因元件或不同蛋白结构域之间不同于原始基因组序列的新组合，形成新基因；优选地，还包括(2)设计可特异区分上述新组合的引物对，通过PCR鉴定筛选出含有上述新基因的细胞或组织，测序确定基因元件新组合的特征序列；以及(3)对上述筛选出的细胞或组织进行培养获得T0代生物体，通过对T0、T1连续2代或3代以上的生物体进行PCR鉴定和测序，筛选出在不同世代间稳定遗传包含上述基因元件新组合的特征序列的生物体，即在生物体内创制出了可稳定遗传的新基因；任选地，还包括(4)对新基因功能相关的生物学性状或表型进行测试，确定能给生物体带来有益性状的基因型，获得可稳定遗传的新功能基因。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中在生物体基因组中两个不同的特定位置上同时产生DNA断裂，所述特定位置分别是一个基因的编码区和启动子之间的基因组位点和另一个具有不同表达模式的基因的编码区和启动子之间的基因组位点，最终产生两个具有不同表达模式的基因其中之一的启动子和另一基因的编码区的组合；优选地，最终产生强启动子和目标基因编码区的组合。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中在生物体基因组中三个不同的特定位置上同时产生DNA断裂，所述特定位置分别是能够切割出一个高表达基因的启动子片段的两个基因组位点和另一个不同表达模式基因的编码区和启动子之间的基因组位点；或者一个高表达基因的启动子和编码区之间的基因组位点和能够切割出另一个不同表达模式基因的编码区片段的两个基因组位点；然后通过对上述位点的基因编辑产生启动子片段插入另一基因的编码区上游或编码区片段插入另一基因启动子下游的易位编辑事件，最终产生两个具有不同表达模式的基因其中之一的启动子和另一基因的编码区的组合；优选地，最终产生强启动子和目标基因编码区的组合。4.根据权利要求1
‑
3中任意一项所述的方法，其特征在于，所述的“至少两个不同的特定位置”位于同一条染色体或不同染色体上；优选地，在至少两个不同基因上的特定位置或在同一基因上的至少两个不同的特定位置，所述的“至少两个不同基因”的转录方向可以相同，也可以不同。5.根据权利要求1
‑
4中任意一项所述的方法，其特征在于，所述“基因元件”包括基因的启动子、5
’
非编码区、编码区或非编码RNA区、3
’
非编码区和终止子。6.根据权利要求1
‑
5中任意一项所述的方法，其特征在于，所述不同基因元件的组合为两个具有不同表达模式的基因其中之一的启动子和另一基因的编码区或非编码RNA区的组合，或两个具有不同表达模式的基因其中之一的启动子至5
’
非编码区和另一基因的编码区或非编码RNA区的组合，或同一基因内相邻基因元件的组合；优选地，所述“不同表达模式”为基因表达水平强弱的差异、基因表达组织特异性的差异或基因表达发育时期特异性的差异。7.根据权利要求1
‑
4中任意一项所述的方法，其特征在于，所述“蛋白结构域”是指对应于蛋白质特定功能结构域的DNA片段；优选地，包括核定位信号、叶绿体导肽、线粒体导肽、
磷酸化位点、甲基化位点、跨膜结构域、DNA结合结构域、转录激活结构域、受体激活结构域或酶催化中心。8.根据权利要求1
‑
4和7中任意一项所述的方法，其特征在于，所述不同蛋白结构域的组合为两个具有不同亚细胞定位的蛋白编码基因其中之一的定位信号区域和另一基因的成熟蛋白编码区域的组合，或两种不同生物学功能的蛋白结构域的组合，或同一基因内相邻蛋白结构域的组合；优选地，所述“不同亚细胞定位”包括核定位、胞质定位、细胞膜定位、叶绿体定位、线粒体定位或内质网膜定位；优选地，所述“不同生物学功能”包括识别特异DNA或RNA保守序列、激活基因表达、结合蛋白配体、结合小分子信号、离子结合或特异的酶促反应。9.根据权利要求1
‑
5和7中任意一项所述的方法，其特征在于，所述基因元件和蛋白结构域的组合为同一基因内蛋白结构域与相邻的启动子、5
’
非编码区、3
’
非编码区或终止子的组合。10.根据权利要求1
‑
9中任意一项所述的方法，其特征在于，所述的生物体是非人动物、植物或真菌。11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不同基因元件的组合选自以下任意一种：(1)其中一个为植物内源强启动子或强启动子至5
’
非编码区，另外一个为同一植物的HPPD基因编码区、EPSPS基因编码区、PPO基因编码区、ALS基因编码区、ACCase基因编码区、GS基因编码区、PDS基因编码区、DHPS基因编码区、DXPS基因编码区、HST基因编码区、SPS基因编码区、纤维素合成酶基因编码区、VLCFAS基因编码区、脂肪酸硫酯酶基因编码区、丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶基因编码区或番茄红素环化酶基因编码区；(2)其中一个为生物内源强启动子或强启动子至5
’
非编码区，另外一个为同一生物的任一P450家族基因编码区；(3)其中一个为水稻或玉米内源强启动子或强启动子至5
’
非编码区，另外一个为同一生物的OsCYP81A6基因或ZmCYP81A9基因编码区；(4)其中一个为玉米内源强启动子或强启动子至5
’
非编码区，另外一个为玉米ZMM28(Zm00001d022088)基因、ZmKNR6基因或ZmBAM1d基因编码区；(5)其中一个为水稻内源强启动子或强启动子至5
’
非编码区，另外一个为水稻基因COLD1或OsCPK24的编码区；(6)其中一个为生物内源强启动子或强启动子至5
’
非编码区，另外一个为同一生物的任一ATP
‑
binding cassette(ABC)转运蛋白家族基因编码区；(7)其中一个为植物内源强启动子或强启动子至5
’
非编码区，另外一个为同一植物的任一NAC转录因子家族基因(如OsNAC045、OsNAC67、ZmSNAC1、OsNAC006、OsNAC42、OsSNAC1或OsSNAC2)编码区；(8)其中一个为植物内源强启动子或强启动子至5
’
非编码区，另外一个为同一植物的任一MYB转录因子家族基因编码区、MADS转录因子家族基因编码区、DREB转录因子家族基因编码区或bZIP转录因子家族基因编码区；(9)其中一个为表A中记载的任一泛表达或组织特异性表达水稻基因的启动子，另一个为任一不同于所选启动子对应水稻基因的其它基因的蛋白编码区或非编码RNA区；
(10)其中一个选自表B至表K中记载的任一生物功能基因的蛋白编码区或非编码RNA区，另一个为所选基因对应生物基因组中任一不同于所选功能基因的其它基因的启动子区；(11)其中一个为生物内源强启动子或强启动子至5
’
非编码区，另外一个为同一生物的任一GST(glutathione
‑
S
‑
transferases)家族基因编码区；(12)其中一个为小麦或玉米内源强启动子或强启动子至5
’
非编码区，另外一个为同一生物的小麦GST Cla47(AY064480.1)基因或小麦GST 19E50(AY064481.1)或小麦GST 28E45(AY479764.1)或玉米ZmGSTIV或玉米ZmGST6或玉米ZmGST31或玉米GSTI或玉米GSTIII或玉米GSTIV或玉米GST5或玉米GST7基因编码区；(13)其中一个为水稻内源强启动子或强启动子至5
’
非编码区，另外一个选自水稻GIF1(Os04g0413500)，NOG1(Os01g075220)，LAIR(Os02g0154100)，OSA1(Os03g0689300)，OsNRT1.1A(Os08g0155400)，OsNRT2.3B(Os01g0704100)，OsRac1(Os01g0229400)，OsNRT2.1(Os02g0112100)，OsGIF1(Os03g0733600)，OsNAC9(Os03g0815100)，CPB1/D11/GNS4(Os04g0469800)，miR1432(Os04g0436100)，OsNLP4(Os09g0549450)，RAG2(Os07g0214300)，LRK1(Os02g0154200)，OsNHX1(Os07t0666900)，GW6(Os06g0623700)，WG7(Os07g0669800)，D11/OsBZR1(Os04g0469800，Os07g0580500)，OsAAP6(Os07g0134000)，OsLSK1(Os01g0669100)，IPA1(Os08g0509600)，SMG11(Os01g0197100)，CYP72A31(Os01g0602200)，SNAC1(Os03g0815100)，ZBED(Os01g0547200)，OsSta2(Os02g0655200)，OsASR5(Os11g0167800)，OsCPK4(Os02g03410)，OsDjA9(Os06g0116800)，EUI(Os05g0482400)，JMJ705(Os01g67970)，WRKY45(Os05t0322900)，OsRSR1(Os05g0121600),OsRLCK5(Os01g0114100)，APIP4(Os01g0124200)，OsPAL6(Os04t0518400)，OsPAL8(Os11g0708900)，TPS46(Os08t0168000)，OsERF3(Os01g58420)和OsYSL15(Os02g0650300)中任意一个基因蛋白编码区；(14)其中一个为鱼类内源强启动子，另外一个为所选鱼类的GH1(growth hormone 1)基因编码区。12.一种采用权利要求11所述方法产生的新基因，其特征在于，通过所述不同基因元件的组合(1)
‑
(14)中任意一种形成的新基因分别具有如下性状：(1)所述新基因分别相对于植物内源野生型HPPD基因、EPSPS基因、PPO基因、ALS基因、质体ACCase基因、GS基因、PDS基因、DHPS基因、DXPS基因、HST基因、SPS基因、纤维素合成基因、VLCFAS基因、脂肪酸硫酯酶基因、丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶基因或番茄红素环化酶基因表达水平上调；(2)所述新基因分别相对于相应生物内源野生型P450基因表达水平上调；(3)所述新基因分别相对于水稻内源OsCYP81A6基因或玉米内源ZmCYP81A9基因其表达水平上调；(4)所述新基因分别相对于植物内源野生型ZMM28基因、ZmKNR6基因或ZmBAM1d基因表达水平上调；(5)所述新基因分别相对于水稻内源野生型COLD1或OsCPK24基因表达水平上调；(6)所述新基因分别相对于相应生物内源野生型ATP
‑
binding cassette(ABC)转运蛋白基因表达水平上调；
(7)所述新基因分别相对于相应植物内源野生型NAC转录因子基因表达水平上调；(8)所述新基因分别相对于相应植物内源野生型MYB转录因子基因、MADS转录因子家族基因、DREB转录因子家族基因编码区或bZIP转录因子家族基因表达水平上调；(9)所述新基因分别相对于所选蛋白编码区或非编码RNA区的内源水稻基因其表达模式发生改变；(10)所述新基因分别相对于所选功能基因其表达模式发生改变；(11)所述新基因分别相对于相应生物内源GST(glutathione
‑
S
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transferases)家族基因表达水平上调；(12)所述新基因分别相对于内源小麦GST Cla47(AY064480.1)基因或小麦GST 19E50(AY064481.1)或小麦GST 28E45(AY479764.1)或玉米ZmGSTIV或玉米ZmGST6或玉米ZmGST31或玉米GSTI或玉米GSTIII或玉米GSTIV或玉米GST5或玉米GST7基因其表达水平上调；(13)所述新基因分别相对于相应的内源基因其表达水平上调；(14)所述新基因为鱼类内源高表达GH1基因。13.一种如权利要求1
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11中任意一项所述方法产生的新基因在动植物育种中的应用。14.一种如权利要求12所述新基因分别在以下方面上的应用：(1)在提高植物细胞、植物组织、植物部分或植物的HPPD抑制剂类、EPSPS抑制剂类、PPO抑制剂类、ALS抑制剂类、ACCase抑制剂类、GS抑制剂类、PDS抑制类、DHPS抑制剂类、DXPS抑制剂类、HST抑制剂类、SPS抑制剂类、纤维素合成抑制剂类、VLCFAS抑制剂类、脂肪酸硫酯酶抑制剂类、丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶抑制剂类或番茄红素环化酶抑制剂类除草剂抗性或耐受性上的应用；(2)所述新基因在提高生物解毒能力、提高抗逆性或次生产物代谢能力上的应用；(3)所述新基因分别在提高水稻或玉米除草剂耐受性上的应用；(4)所述新基因在提高玉米产量上的应用；(5)所述新基因在提高水稻抗寒性上的应用；(6)所述新基因在提高生物解毒能力或提高抗逆性上的应用；(7)所述新基因在提高植物抗逆性上或提高植物产量上的应用；(8)所述新基因在提高植物抗逆性上或调控植物生长发育上的应用；(9)所述新基因在调控水稻生长发育上的应用；(10)所述新基因在调控生物生长发育上的应用；(11)所述新基因在提高生物解毒能力或提高抗逆性上的应用；(12)所述新基因分别在提高小麦或玉米除草剂抗性或耐受性上的应用；(13)所述新基因在水稻育种上的应用；(14)所述鱼类内源高表达GH1基因在鱼类育种中的应用。15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不同蛋白结构域的组合选自以下任意一种：(a)其中一个为小麦内源蛋白叶绿体定位信号结构域，另外一个为小麦胞质定位磷酸葡萄糖异构酶(PGIc)成熟蛋白编码区域；(b)其中一个为水稻蛋白叶绿体定位信号结构域(CTP)，另外一个为OsGLO3、OsOX...

【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ五一IntClC一二N一五一零，
申请(专利权)人：青岛清原化合物有限公司，
类型：发明
国别省市：