一种土壤微生物DNA的提取试剂盒及提取方法技术

本发明专利技术公开了一种土壤微生物DNA的提取试剂盒，包括研磨材料、裂解缓冲液、绑定液、漂洗液a、漂洗液b和洗脱液；其中，所述研磨材料由研磨珠和钢珠组成；所述裂解缓冲液包括CTAB、SDS、NaCl、Tris

【技术实现步骤摘要】
一种土壤微生物DNA的提取试剂盒及提取方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种土壤微生物DNA的提取试剂盒及提取方法。

技术介绍

[0002]土壤中的细菌真菌等微生物大多数都是不可培养的，但是随着近些年NGS(高通量测序)技术的快速发展，尤其是建立在NGS技术之上的宏基因组测序和扩增子测序等技术，无需对土壤微生物进行分离培养就能实现微生物群落结构相关的分析。
[0003]由于土壤样本的类型复杂，尤其是土壤中的腐质酸类物质在提取过程中很难有效去除，腐殖质有类似于核酸的物理化学性质。因此，大部分腐殖质连同被吸附的有机分子一起与DNA共同分离。腐殖酸对后续的有生物酶参与的分析，比如PCR扩增、内切酶消化、高通量测序等有极大的抑制作用。在大多数宏基因组研究中，从各种来源的土壤样本中分离出不含腐殖质的高纯度宏基因组DNA，是很大的挑战。而NGS技术的基础在于对DNA的提取，现有土壤微生物DNA的提取过程较为繁琐、效率较低，因此无法兼顾DNA提取效率与DNA提取质量。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种土壤微生物DNA的提取试剂盒及提取方法。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术手段：
[0006]本专利技术的第一方面在于提供一种土壤微生物DNA的提取试剂盒，包括研磨材料、裂解缓冲液、绑定液、漂洗液a、漂洗液b和洗脱液；
[0007]其中，所述研磨材料由1mm研磨珠和4mm钢珠组成；所述裂解缓冲液包括CTAB、SDS、NaCl、Tris
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HCl和EDTA；所述绑定液包括磁珠、PEG6000和NaCl；所述漂洗液a包括异硫氰酸胍、盐酸胍、乙醇和Tris
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HCl；所述漂洗液b包括乙醇和Tris
‑
HCl；所述洗脱液为Tris
‑
HCl缓冲液。
[0008]优选地，所述研磨材料由0.1
‑
0.3g的1mm研磨珠和1
‑
3颗的4mm钢珠组成，用于破裂细胞，使细胞更易于裂解；
[0009]优选地，所述解缓冲液中，CTAB的浓度为0.1wt％
‑
1wt％、SDS的浓度为0.1wt％
‑
1wt％、NaCl的浓度为2
‑
6M、Tris
‑
HCl的浓度为0.1
‑
0.3M，EDTA的浓度为0.1
‑
0.3；所述裂解缓冲液用于对细胞进行裂解，释放核酸，同时对一些杂质进行络合；
[0010]优选地，所述绑定液中PEG6000的浓度为25wt％
‑
35wt％，NaCl的浓度为1
‑
3M；磁珠为硅基磁珠，用于定向吸附核酸；
[0011]优选地，所述漂洗液a中，异硫氰酸胍的浓度为1
‑
3M、盐酸胍的浓度为2
‑
4M、乙醇的体积分数为25％
‑
35％、Tris
‑
HCl的浓度为0.3
‑
0.7M。所述漂洗液a用于去除残余的盐类物质；
[0012]优选地，所述漂洗液b中，乙醇的体积分数为65％
‑
75％、Tris
‑
HCl的浓度为0.1
‑
0.3M；所述漂洗液b用于进一步去除残余的盐类物质；
[0013]优选地，所述洗脱液是浓度为8
‑
12mM的Tris
‑
HCl缓冲液，用于洗脱被磁珠吸附的核酸。
[0014]本专利技术的第二方面在于提供本专利技术第一方面所述的试剂盒在土壤DNA提取中的应用。
[0015]本专利技术的第三方面在于提供一种本专利技术第一方面所述的试剂盒在用于土壤DNA提取的提取方法，具体步骤包括：
[0016]S1，将研磨材料加入到容器a中，后加入土壤样品，接着加入裂解缓冲液，研磨10
‑
15min，后在60
‑
70℃的水中水浴5
‑
15min；
[0017]S2，将容器a冷却至室温，后以11000
‑
13000rpm的转速离心2
‑
5min；并吸取上清液到容器2中；
[0018]S3，向容器b中加入绑定液，后将容器b放到混匀仪上，室温振荡混匀1
‑
2min；
[0019]S4，将步骤S3混匀后的容器b放置在专用的磁力架上，静置，待磁珠完全吸附后，弃上清液；
[0020]S5，向步骤S4弃完上清液的容器b中加入漂洗液a，后将容器b转移到混匀仪上，振荡混匀，后将容器b放置在专用的磁力架上静置，待磁珠完全吸附后，弃上清液；
[0021]S6，向步骤S5弃完上清液的容器b中加入漂洗液b，后将容器b转移到混匀仪上，振荡混匀，后将容器b放置在专用的磁力架上静置，待磁珠完全吸附后，弃上清液；
[0022]S7，将容器b在室温下晾干；后加入洗脱液，并转移到混匀仪上，在60
‑
70℃下恒温振荡混匀1
‑
3min，后将容器b放置在专用的磁力架上静置，待磁珠完全吸附后，将上清液转移至容器c中；其中，容器c中的上清液中含有土壤微生物DNA样本。
[0023]优选地，所述步骤S1中土壤样品选自稻田根际土壤、堆肥周围土壤、花园土壤、山林土、河道淤泥和厌氧污泥中的一种。
[0024]优选地，所述容器a、容器b和容器c分别为EP管a、EP管b和EP管c。
[0025]本专利技术的有益效果
[0026]相对于现有技术，本专利技术具有以下有益效果：
[0027]本专利技术采用独特的研磨体系，更有助于裂解细胞；并且本专利技术无需使用氯仿、苯酚等有毒有害的化学试剂，依靠绑定液和漂洗液即可达到较好的除杂效果；再者本专利技术采用磁珠纯化，与相关设备结合使用，可以有效提高DNA的提取效率。
附图说明
[0028]图1示出了本专利技术实施例3对土壤DNA提取的电泳结果图。
[0029]图2示出了本专利技术实施例4和对比例1对土壤DNA提取的电泳结果图。
具体实施方式
[0030]除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其
等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。
[0031]本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种土壤微生物DNA的提取试剂盒，其特征在于，包括研磨材料、裂解缓冲液、绑定液、漂洗液a、漂洗液b和洗脱液；其中，所述研磨材料由研磨珠和钢珠组成；所述裂解缓冲液包括CTAB、SDS、NaCl、Tris
‑
HCl和EDTA；所述绑定液包括磁珠、PEG6000和NaCl；所述漂洗液a包括异硫氰酸胍、盐酸胍、乙醇和Tris
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HCl；所述漂洗液b包括乙醇和Tris
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HCl；所述洗脱液为Tris
‑
HCl缓冲液。2.根据权利要求1所述的一种土壤微生物DNA的提取试剂盒，其特征在于，研磨材料由0.1
‑
0.3g的1mm研磨珠和1
‑
3颗的4mm钢珠组成。3.根据权利要求1所述的一种土壤微生物DNA的提取试剂盒，其特征在于，所述解缓冲液中，CTAB的浓度为0.1wt％
‑
1wt％、SDS的浓度为0.1wt％
‑
1wt％、NaCl的浓度为2
‑
6M、Tris
‑
HCl的浓度为0.1
‑
0.3M，EDTA的浓度为0.1
‑
0.3。4.根据权利要求1所述的一种土壤微生物DNA的提取试剂盒，其特征在于，所述绑定液中PEG6000的浓度为25wt％
‑
35wt％，NaCl的浓度为1
‑
3M；磁珠为硅基磁珠。5.根据权利要求1所述的一种土壤微生物DNA的提取试剂盒，其特征在于，所述漂洗液a中，异硫氰酸胍的浓度为1
‑
3M、盐酸胍的浓度为2
‑
4M、乙醇的体积分数为25％
‑
35％、Tris
‑
HCl的浓度为0.3
‑
0.7M。6.根据权利要求1所述的一种土壤微生物DNA的提取试剂盒，其特征在于，所述漂洗液...

【专利技术属性】
技术研发人员：李振，吴昆林，蒙艳婷，殷楠楠，
申请(专利权)人：杭州联川生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：