【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于单细胞悬液处理，具体涉及三层密度梯度离心分离纯化单细胞悬液的方法。
技术介绍
1、密度梯度离心在离心管内用一定的介质形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。早在20世纪70年代，boyum描述了一种使用密度梯度溶液从人血液中分离单个核细胞的离心方法，这种方法已被用于许多免疫学研究。密度梯度离心又可分为差速区带离心法和等密度区带离心法两种。差速区带离心法时当不同的颗粒间存在沉降速度差时，在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法。等密度区带离心法是通过离心管中预先放置好梯度介质，样品加在梯度液面上通过离心形成区带的方法。随着密度梯度离心方法的不断发展现在广泛应用于细胞核和细胞器的分离如单细胞抽核分离细胞核和碎片，线粒体等细胞器分离等；蛋白纯化，用于不同蛋白的分离；病毒分离等。
2、单细胞转录组测序是在单细胞水平对转录组进行测序的一项新技术，可发现细胞群体中真正起作用的细胞，特别适合对高度异质性的干细胞、肿瘤细胞及胚胎发育早期的细胞群体进行研究，重新认识细胞分子机制和基因调控网络。单细胞rna测序(scrna-seq)技术已成为揭示单个细胞内rna转录本的异质性和复杂性，以及揭示高度组织化的不同细胞类型和功能的最先进方法。自2009年首次发现以来，tang等人实现单细胞rna测序方法的第一个概念和技术突破。这项研究带来的概念和技术开辟了一条扩大细胞数量的新途径，并首次使兼容的高通量rna测序成为可能。s
技术实现思路
1、为了解决上述问题中的至少一种，本专利技术提供了一种三层密度梯度离心分离纯化单细胞悬液的方法。
2、为了达到上述目的，本专利技术采用了如下技术手段：
3、本专利技术提供了三层密度梯度离心分离纯化单细胞悬液的方法，所述方法包括如下步骤：
4、(1)对样本组织进行单细胞解离，离心得到单细胞沉淀；
5、(2)用第一浓度的ficoll重悬解离后得到的单细胞沉淀，得到单细胞悬液；
6、(3)取第二浓度的ficoll于离心管a中，第二浓度高于第一浓度；将步骤(1)中的单细胞悬液缓慢地加入到离心管a中，使单细胞悬液于ficoll分层；
7、(4)向离心管a的上层加入pbs溶液，注意分层；
8、(5)将离心管a置于离心机中，进行密度梯度离心；
9、(6)离心管b中加入含20％fbs的rpmi-1640培养液；取完成步骤(5)离心管a的中间白膜层细胞加入到离心管b中；
10、(7)将离心管b置于离心机中，进行离心清洗后收集沉淀；
11、(8)向沉淀中加入含5％fbs的rpmi-1640培养液进行重悬，即得分离纯化的单细胞悬液。
12、在本专利技术的一些实施方案中，所述ficoll的第一浓度小于第二浓度，第一浓度和第二浓度范围为1.050g/ml-1.090g/ml。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述ficoll的第一浓度为1.050g/ml，所述ficoll的第二浓度为1.090g/ml。ficoll的第一浓度小于第二浓度，使得细胞夹在第一浓度和第二浓度分界处，让与细胞密度不同的碎片达到分离的目的，第一浓度于第二浓度差太低则会导致大量细胞损失，浓度太高则会导致碎片与细胞无法分离。
13、在本专利技术的一些实施方案中，步骤(5)中密度梯度离心的条件是400-600g，25-35min，4℃，升速：9，降速：1；优选地，密度梯度离心的条件是500g，30min，4℃，升速：9，降速：1。
14、在本专利技术的一些实施方案中，步骤(7)中离心清洗的条件是400-600g，3-8min，4℃，升速：9，降速：1；优选地，离心清洗的条件是500g，5min，4℃，升速：9，降速：1。
15、在本专利技术的一些实施方案中，步骤(1)中的单细胞解离还包括红细胞裂解的步骤。单细胞解离和红细胞裂解采用常规方法均可。
16、本专利技术的有益效果
17、相对于现有技术，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了三层密度梯度离心分离纯化单细胞悬液的方法，该方法可以去除单细胞悬液中的碎片，并能保证细胞类型稳定和细胞形态及细胞内rna完整性。可以去除死细胞，显著的提升回收细胞活率，并且该方法操作简单、成本低。可以去除细胞悬液中高线粒体比例的细胞，提高单细胞数据质量。
18、单细胞悬液三层密度梯度离心方法比已有二层密度梯度离心方案去除效率更高。使用本专利技术提供的方法不仅仅可以去除密度较大的碎片而且可以用上层的pbs去除密度较小的碎片，增加了样本的适用范围，可以广泛推广应用。
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1.三层密度梯度离心分离纯化单细胞悬液的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的三层密度梯度离心分离纯化单细胞悬液的方法，其特征在于，所述Ficoll的第一浓度小于第二浓度，第一浓度和第二浓度范围为1.050g/mL-1.090g/mL。
3.根据权利要求1所述的三层密度梯度离心分离纯化单细胞悬液的方法，其特征在于，步骤(5)中密度梯度离心的条件是400-600g，25-35min，4℃，升速：9，降速：1。
4.根据权利要求1所述的三层密度梯度离心分离纯化单细胞悬液的方法，其特征在于，步骤(7)中离心清洗的条件是400-600g，3-8min，4℃，升速：9，降速：1。
5.根据权利要求1所述的三层密度梯度离心分离纯化单细胞悬液的方法，其特征在于，步骤(1)中的单细胞解离还包括红细胞裂解的步骤。
【技术特征摘要】
1.三层密度梯度离心分离纯化单细胞悬液的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的三层密度梯度离心分离纯化单细胞悬液的方法，其特征在于，所述ficoll的第一浓度小于第二浓度，第一浓度和第二浓度范围为1.050g/ml-1.090g/ml。
3.根据权利要求1所述的三层密度梯度离心分离纯化单细胞悬液的方法，其特征在于，步骤(5)中密度梯度离...
【专利技术属性】
技术研发人员：俞陈毅，李璐璐，郎秋蕾，罗伦，王佳铖，
申请(专利权)人：杭州联川生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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