一种用于构建cfDNA甲基化NGS文库的试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了一种cfDNA甲基化NGS文库的构建方法：重亚硫酸盐处理后的cfDNA单链，利用末端转移酶以NTP为底物，在单链3’端加上2‑4个ATP尾；以T4RNA连接酶在单链3’端连接单链接头；以二链合成引物，利用taq DNA聚合酶进行二链合成，在合成末端多加一个A碱基；利用DNA连接酶，以TA克隆的方式连接双链接头；利用建库index引物进行PCR扩增构建文库。该方法先转化后建库，避免l传统先建库后转化DNA断裂后造成大量数据丢失的问题，同时采用单链和双链两种接头连接方式，规避了普通单链建库需要采用随机引物合成的步骤，既避免了随机引物不可从头合成的问题，又避免了随机引物合成的偏好性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子基因学领域，具体涉及一种用于构建cfdna甲基化ngs文库的试剂盒和方法。

技术介绍

1、1.血浆游离dna(cell free dna)

2、cfdna(cell free dna)又称循环dna，是指游离于细胞之外的dna分子，这些dna分子主要来源于正常细胞某些特定释放过程、细胞凋亡、细胞坏死、以及癌细胞生长浸润过程中的释放，其大小主要集中在160-170到数百bp，半衰期在数小时左右血液中的cfdna水平和种类与包括肿瘤在内的多种疾病相关，液体活检，特别是对cfdna的分析，已经成为肿瘤学中一种具有广阔应用前景的非侵入性诊断方法。

3、2.新一代测序(ngs)技术进行cfdna甲基化测序

4、dna甲基化是最早被发现，也是最为常见的表观遗传现象，在真核生物维持基因组稳定性和调节细胞周期、凋亡以及胚胎发育等重要生理功能方面起着重要作用。在肿瘤细胞中普遍存在着全基因范围内的dna甲基化水平下降以及部分基因cpg岛甲基化水平上升。低水平的dna甲基化不但能够导致基因组稳定性的降低和突变率的增加，还可以本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种cfDNA甲基化NGS文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种cfDNA甲基化NGS文库的构建方法，其特征在于：所述单链接头序列如SEQ ID NO.1所示，所述双链接头为Y型接头，第一序列如SEQ ID NO.2所示，第二序列如SEQ ID NO.3所示，所述二链合成引物序列如SEQ ID NO.4所示；所述建库index引物包括建库index引物50X和建库index引物70X，建库index引物50X序列由SEQ ID NO.5、8碱基barcode序列、SEQ ID NO.6依次连接组成；建库index引物70X序列由SEQ I...

【技术特征摘要】

1.一种cfdna甲基化ngs文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种cfdna甲基化ngs文库的构建方法，其特征在于：所述单链接头序列如seq id no.1所示，所述双链接头为y型接头，第一序列如seq id no.2所示，第二序列如seq id no.3所示，所述二链合成引物序列如seq id no.4所示；所述建库index引物包括建库index引物50x和建库index引物70x，建库index引物50x序列由seq id no.5、8碱基barcode序列、seq id no.6依次连接组成；建库index引物70x序列由seq id no.7、8碱基barcode序列、seq id no.8依次连接组成。

3.根据权利要求1所述的一种cfdna甲基化ngs文库的构建方法，其特征在于：步骤(1)中单链加尾方法如下：重亚硫酸盐处理后的cfdna单链中加入tdt缓冲液、cocl2、atp，末端转移酶，37℃孵育25-35min，磁珠纯化。

4.根据权利要求1所述的一种cfdna甲基化ngs文库的构建方法，其特征在于：步骤(2)中单链接头连接方法如下：步骤(1)中得到的cfdna，加入单链接头，90-95℃高温变性2-5min，加入t4 rna连接酶反应缓冲液、peg8000、atp、t4 rna连接酶，混匀，25℃孵育100-150min，磁珠纯化。

5.根据权利要求1所述的一种cfdna甲基化ngs文库的构建方法，其特征在于：步骤(3)中二链合成方法如下：步骤(2)...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁洪，李璐璐，潘石玄伟，
申请(专利权)人：杭州联川生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：