【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子基因学领域，具体涉及一种用于构建cfdna甲基化ngs文库的试剂盒和方法。
技术介绍
1、1.血浆游离dna(cell free dna)
2、cfdna(cell free dna)又称循环dna，是指游离于细胞之外的dna分子，这些dna分子主要来源于正常细胞某些特定释放过程、细胞凋亡、细胞坏死、以及癌细胞生长浸润过程中的释放，其大小主要集中在160-170到数百bp，半衰期在数小时左右血液中的cfdna水平和种类与包括肿瘤在内的多种疾病相关，液体活检，特别是对cfdna的分析，已经成为肿瘤学中一种具有广阔应用前景的非侵入性诊断方法。
3、2.新一代测序(ngs)技术进行cfdna甲基化测序
4、dna甲基化是最早被发现，也是最为常见的表观遗传现象，在真核生物维持基因组稳定性和调节细胞周期、凋亡以及胚胎发育等重要生理功能方面起着重要作用。在肿瘤细胞中普遍存在着全基因范围内的dna甲基化水平下降以及部分基因cpg岛甲基化水平上升。低水平的dna甲基化不但能够导致基因组稳定性的降低和突变率的增加，还可以通过异常激活多种原癌基因的表达从而导致恶性肿瘤的发生。高水平的dna甲基化往往能够通过降低肿瘤抑制基因的转录活性继而对该基因的表达产生影响，例如表达降低、表达沉默，从而间接地诱导恶性肿瘤的发生。
5、cfdna甲基化可在肿瘤发生的早期被检测到，而且具有较好的稳定性，因此cfdna甲基化成为肿瘤液体活检中一个极具价值的标志物。因此，以二代测序技术检测cfdna甲基化，
6、现有技术的缺陷和不足：
7、虽然采用cfdna进行甲基化检测有诸如：非侵入，可重复，无异质性等优点，但是对于二代测序来说，对cfdna进行甲基化检测的建库，却是实验实践中的一个难点。
8、究其原因，在于血液中的cfdna含量较低，正常1ml血浆中cfdna含量约1-10ng，肿瘤病人和孕妇含量相对高一些，但是也只有几倍的差异。一次活检的cfdna量很大概率只有几十ng，而在甲基化文库构建时采用重亚硫酸盐对样本进行处理，这种处理会损害dna的完整性，可能造成90％的样本dna断裂，如采用传统的双链加接头后再进行重亚硫酸盐处理，一旦该过程中dna发生断裂，会直接造成后续pcr时，断裂的dna不能作为模板，从而丢失大量数据。
9、为了规避dna断裂造成的文库数据丢失经过重亚硫酸盐转化后的dna，大部分是单链状态，单链dna如果采用接头直接连接的方式，效率很低。因此，针对这种情况研究者又开发了各种针对单链dna加接头的方法。
10、但是目前使用的单链接头连接方法，还需要以随机引物进行一端接头的引入，而随机引物会造成文库构建会有很大的偏好性，也一样容易造成数据失真和丢失。
技术实现思路
1、为了解决上述问题中的至少一种，本专利技术提供了一种用于构建cfdna甲基化ngs文库的试剂盒和方法，该方法先转化后建库，避免了传统先建库后转化dna断裂后造成大量数据丢失的问题，同时连接效率高。
2、为了达到上述目的，本专利技术采用了如下技术手段：
3、本专利技术的第一方面提供了一种cfdna甲基化ngs文库的构建方法，包括如下步骤：
4、(1)重亚硫酸盐处理后的cfdna单链，利用末端转移酶以ntp作为底物，在单链3’端加上2-4个atp尾；
5、(2)以t4 rna连接酶在单链3’端进行单链接头连接；
6、(3)以二链合成引物，利用taq dna聚合酶进行二链合成，并在合成末端多加一个a碱基；
7、(4)利用dna连接酶，以ta克隆的方式进行双链接头的连接；
8、(5)利用index引物进行pcr扩增构建文库。
9、在本专利技术的一些实施方案中，所述单链接头序列如seq id no.1所示，其5’端含有磷酸化集团，所述双链接头为y型接头，第一序列如seq id no.2所示，其5’端含有磷酸化集团，第二序列如seq id no.3所示，所述二链合成引物序列如seq id no.4所示；所述建库index引物包括建库index引物50x和建库index引物70x，建库index引物50x序列由seq idno.5、8碱基barcode序列、seq id no.6依次连接组成；建库index引物70x序列由seq idno.7、8碱基barcode序列、seq id no.8依次连接组成。barcode序列中的8个碱基，每一个碱基独立地可以是a、g、c、t中的任一个。
10、在本专利技术的一些实施方案中，步骤(1)中单链加尾方法如下：重亚硫酸盐处理后的cfdna单链中加入tdt缓冲液、cocl2、atp，末端转移酶，37℃孵育25-35min，磁珠纯化。优选地，重亚硫酸盐处理后的cfdna单链中加入2μl tdt buffer、2μl 2.5mm cocl2、0.5μl 10mmatp，0.5μl 20units/μl terminal transferase(neb m0315)，补水至20μl，37℃孵育30min，加入60μl ampurexp磁珠进行产物纯化，最终融水10μl。
11、在本专利技术的一些实施方案中，步骤(2)中单链接头连接方法如下：步骤(1)中得到的cfdna，加入单链接头，90-95℃高温变性2-5min，加入t4 rna连接酶反应缓冲液、atp、t4rna连接酶、peg8000，混匀，25℃孵育100-150min，磁珠纯化。优选地，步骤(1)中得到的cfdna 10μl，加入1-2μl浓度为2μm的单链接头，94℃高温变性2-5min，加入2μl 10×t4 rna连接酶反应缓冲液、1-2μl浓度为10mm的atp、1μl t4 rna连接酶(neb m0204)、5μlpeg8000，补水至20μl，混匀，25℃孵育120min。加入60μl ampurexp磁珠进行产物纯化，最终融水20μl。
12、在本专利技术的一些实施方案中，步骤(3)中二链合成方法如下：步骤(2)中完成单链接头连接的cfdna，加入标准taq反应缓冲液、dntps、热启动taq dna聚合酶，90-95℃孵育25-35s，65-70℃孵育4-8min，70-75℃孵育15-25min，4℃保持，磁珠纯化。优选地，步骤(2)中完成单链接头连接的cfdna 20μl，加入5μl 10x standard taq reaction buffer、0.5-2μl 10mm dntps、0.2-0.5μl hot start taq dna polymerase(neb m0495)，补水至50μl，95℃孵育30s，68℃孵育5min，72℃孵育20min，4℃保持。加入60μl ampurexp磁珠进行产物纯化，最终融水10μl。
13、在本专利技术的一本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种cfDNA甲基化NGS文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种cfDNA甲基化NGS文库的构建方法，其特征在于：所述单链接头序列如SEQ ID NO.1所示，所述双链接头为Y型接头，第一序列如SEQ ID NO.2所示，第二序列如SEQ ID NO.3所示，所述二链合成引物序列如SEQ ID NO.4所示；所述建库index引物包括建库index引物50X和建库index引物70X，建库index引物50X序列由SEQ ID NO.5、8碱基barcode序列、SEQ ID NO.6依次连接组成；建库index引物70X序列由SEQ ID NO.7、8碱基barcode序列、SEQ ID NO.8依次连接组成。
3.根据权利要求1所述的一种cfDNA甲基化NGS文库的构建方法，其特征在于：步骤(1)中单链加尾方法如下：重亚硫酸盐处理后的cfDNA单链中加入TDT缓冲液、CoCl2、ATP，末端转移酶，37℃孵育25-35min，磁珠纯化。
4.根据权利要求1所述的一种cfDNA甲基化NGS文库的构建方法，
5.根据权利要求1所述的一种cfDNA甲基化NGS文库的构建方法，其特征在于：步骤(3)中二链合成方法如下：步骤(2)中完成单链接头连接的cfDNA，加入标准Taq反应缓冲液、dNTPs、热启动Taq DNA聚合酶，90-95℃孵育25-35s，65-70℃孵育4-8min，70-75℃孵育15-25min，4℃保持，磁珠纯化。
6.根据权利要求1所述的一种cfDNA甲基化NGS文库的构建方法，其特征在于：步骤(4)中双链接头连接方法如下：步骤(3)中完成二链合成的cfDNA，T4 DNA连接酶缓冲液、T4 DNA连接酶、退火后的双链接头，20-30℃孵育100-150min，60-70℃孵育8-12min，磁珠纯化。
7.根据权利要求1所述的一种cfDNA甲基化NGS文库的构建方法，其特征在于：步骤(5)中建库的方法如下：完成步骤(4)的产物，建库index引物50X、建库index引物70X、Buffer、DNA聚合酶、dNTP，补水至50μL后进行PCR扩增，磁珠纯化后得到文库。
8.根据权利要求1所述的一种cfDNA甲基化NGS文库的构建方法，其特征在于：步骤(5)中PCR扩增程序为：98℃变性30s，98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸15s，8-12个循环，72℃延伸5min，4℃保持。
9.一种cfDNA甲基化NGS文库的构建试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-8任一项所述的构建方法中用到的各试剂、单链接头、双链接头、二链合成引物以及建库index引物。
10.一种cfDNA甲基化NGS文库在cfDNA甲基化测序中的应用，其特征在于：所述文库采用权利要求1-8的任一项所述的方法构建得到。
...【技术特征摘要】
1.一种cfdna甲基化ngs文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种cfdna甲基化ngs文库的构建方法，其特征在于：所述单链接头序列如seq id no.1所示，所述双链接头为y型接头，第一序列如seq id no.2所示，第二序列如seq id no.3所示，所述二链合成引物序列如seq id no.4所示；所述建库index引物包括建库index引物50x和建库index引物70x，建库index引物50x序列由seq id no.5、8碱基barcode序列、seq id no.6依次连接组成；建库index引物70x序列由seq id no.7、8碱基barcode序列、seq id no.8依次连接组成。
3.根据权利要求1所述的一种cfdna甲基化ngs文库的构建方法，其特征在于：步骤(1)中单链加尾方法如下：重亚硫酸盐处理后的cfdna单链中加入tdt缓冲液、cocl2、atp，末端转移酶，37℃孵育25-35min，磁珠纯化。
4.根据权利要求1所述的一种cfdna甲基化ngs文库的构建方法，其特征在于：步骤(2)中单链接头连接方法如下：步骤(1)中得到的cfdna，加入单链接头，90-95℃高温变性2-5min，加入t4 rna连接酶反应缓冲液、peg8000、atp、t4 rna连接酶，混匀，25℃孵育100-150min，磁珠纯化。
5.根据权利要求1所述的一种cfdna甲基化ngs文库的构建方法，其特征在于：步骤(3)中二链合成方法如下：步骤(2)...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁洪，李璐璐，潘石玄伟，
申请(专利权)人：杭州联川生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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