一种人类基因分型定量用的检测试剂盒及dd-cfDNA检测方法技术

技术编号：41297048 阅读：6 留言：0更新日期：2024-05-13 14:45

本发明专利技术属于基因检测技术领域及基因检测试剂领域，具体涉及一种人类基因分型定量用的检测试剂盒及dd‑cfDNA检测方法。本发明专利技术的试剂盒针对多个SNP位点进行检测，可根据患者的分型结果，选择相应的位点进行dd‑cfDNA检测，可进一步采用数字PCR检测所述受者的生物样本中dd‑cfDNA的含量，实现个体化dd‑cfDNA检测。本发明专利技术试剂盒和方法克服了现有数字PCR检测dd‑cfDNA所存在的耗时、费力以及成本过高的缺陷，能够大幅降低检测的时间和物质成本，且能将分辨率提高到99％，有利于dd‑cfDNA检测的广泛应用，因而具有很好的应用前景。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因检测及基因检测试剂领域，具体涉及一种人类基因分型用的数字pcr试剂盒及dd-cfdna检测方法。

技术介绍

1、现有技术中，移植排斥反应的监测指标灵敏度较低。例如，在血清肌酐异常之前，约有50％的移植肾功能可能已经受损；传统的肝功能检测对评估移植肝排斥反应价值有限；心肌酶谱对心脏移植后急性排斥反应的诊断灵敏度并不是很理想。目前，病理学活检是排斥反应诊断的“金标准”，但其具有侵入性和潜在并发症。因此，建立更有效、无创的方法来监测移植物状态显得尤其重要。

2、已有较多研究提示供者来源细胞游离dna(donor-derived cell-free dna，dd-cfdna)可快速、定量、安全地评估移植物损伤状态，并反映损伤严重程度，加之cfdna具有半衰期短等特点，因此,dd-cfdna水平可能可以作为器官移植预后的生物标志物，用于移植物损伤和移植排斥的诊断及监测。其作为一种非侵入性、早期诊断移植物损伤、实时监测移植患者排斥的生物标记物潜力巨大，具有实际的临床应用价值。

3、细胞游离dna(cell-free dna，cfdna)是一种可在血液、尿液等体液中检测到的片段化、降解dna。一般认为cfdna起源于细胞的坏死、凋亡。坏死的细胞被巨噬细胞等吞噬，释放经过消化的dna到血液中形成cfdna。cfdna主要来源于血细胞、组织细胞、脂肪细胞等，在特定条件下还可能来源于肿瘤、移植物或胎儿等，接受器官移植患者的血浆cfdna中含有移植物来源的cfdna。移植排斥反应会释放dd-cfdna，在肝移

4、目前，定量检测dd-cfdna是利用数字pcr通过panel盲筛供、受者基因序列的单核苷酸多态性(snp)来区分血浆中dna分子的来源，从而进行dd-cfdna的定量。然而，由于人类的snp位点较多的原因，利用上述数字pcr通过panel盲筛供、受者基因序列的snp来区分血浆中dna分子的方法运用于dd-cfdna检测耗时，费力，且成本过高，不利于其广泛地应用。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种人类基因分型定量用的检测试剂盒及dd-cfdna检测方法，目的在于实现对人的基因进行分型，通过14个位点快速筛选出两个目标(例如器官移植的供者和受者)的1-2个差异化的位点，通过单独定量检测这些差异化位点的dd-cfdna含量，实现快速、高效和低成本的dd-cfdna检测。

2、本专利技术提供一种人类基因分型定量用检测试剂盒，包括用于扩增dna序列多态性位点的荧光探针或引物对；所述dna序列多态性位点包括rs71854214、rs71806826、rs148026204、rs11279479、rs112182521、rs72500714、rs11276661、rs143682014中的至少一种；

3、所述rs71854214对应的荧光探针核苷酸序列如seq id no.29和seq id no.30所示，或所述rs71854214对应的荧光探针核苷酸序列为与seq id no.29和seq id no.30所示序列具有至少90％同一性的同功能序列；所述rs71854214对应的引物对核苷酸序列如seqid no.1和seq id no.2所示，或所述rs71854214对应的引物对核苷酸序列为与seq idno.1和seq id no.2所示序列具有至少90％同一性的同功能序列；

4、所述rs71806826对应的荧光探针核苷酸序列如seq id no.31和seq id no.32所示，或所述rs71806826对应的荧光探针核苷酸序列为与seq id no.31和seq id no.32所示序列具有至少90％同一性的同功能序列；所述rs71806826对应的引物对核苷酸序列如seqid no.3和seq id no.4所示，或所述rs71806826对应的引物对核苷酸序列为与seq idno.3和seq id no.4所示序列具有至少90％同一性的同功能序列；

5、所述rs148026204对应的荧光探针核苷酸序列如seq id no.33和seq id no.34所示，或所述rs148026204对应的荧光探针核苷酸序列为与seq id no.33和seq id no.34所示序列具有至少90％同一性的同功能序列；所述rs148026204对应的引物对核苷酸序列如seq id no.5和seq id no.6所示，或所述rs148026204对应的引物对核苷酸序列为与seqid no.5和seq id no.6所示序列具有至少90％同一性的同功能序列；

6、所述rs11279479对应的荧光探针核苷酸序列如seq id no.35和seq id no.36所示，或所述rs11279479对应的荧光探针核苷酸序列为与seq id no.35和seq id no.36所示序列具有至少90％同一性的同功能序列；所述rs11279479对应的引物对核苷酸序列如seqid no.7和seq id no.8所示，或所述rs11279479对应的引物对核苷酸序列为与seq idno.7和seq id no.8所示序列具有至少90％同一性的同功能序列；

7、所述rs112182521对应的荧光探针核苷酸序列如seq id no.37和seq id no.38所示，或所述rs112182521对应的荧光探针核苷酸序列为与seq id no.37和seq id no.38所示序列具有至少90％同一性的同功能序列；所述rs112182521对应的引物对核苷酸序列如seq id no.9和seq id no.10所示，或所述rs112182521对应的引物对核苷酸序列为与seqid no.9和seq id no.10所示序列具有至少90％同一性的同功能序列；

8、所述rs72500714对应的荧光探针核苷酸序列如seq id no.39和seq id no.40所示，或所述rs72500714对应的荧光探针核苷酸序列为与seq id no.39和seq id no.40所示序列具有至少90％同一性的同功能序列；所述rs72500714对应的引物对核苷酸序列如seqid no.11和seq id no.12所示，或所述rs72500714对应的引物对核苷酸序列为与seq idno.11和seq id no.12所示序列具有至少90％同一性的同功能序列；

9、所述rs143682014对应的荧光探针核苷酸序列如seq id no.41和seq id no.42所示，或所述rs143682014对应的荧光探针本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种人类基因分型定量用检测试剂盒，其特征在于：包括用于扩增DNA序列多态性位点的荧光探针或引物对；所述DNA序列多态性位点包括rs71854214、rs71806826、rs148026204、rs11279479、rs112182521、rs72500714、rs11276661、rs143682014中的至少一种；

2.根据权利要求1所述的人类基因分型定量用检测试剂盒，其特征在于：包括用于扩增DNA序列多态性位点的荧光探针和引物对；所述DNA序列多态性位点包括rs71854214、rs71806826、rs148026204、rs11279479、rs112182521、rs72500714、rs11276661和rs143682014。

3.根据权利要求1所述的人类基因分型定量用检测试剂盒，其特征在于：所述DNA序列多态性位点还包括rs71752266、rs139629754、rs141415483、rs112735629、rs141566886和rs139197112中的至少一种；

4.根据权利要求1～3任一项所述的人类基因分型定量

5.根据权利要求4所述的人类基因分型定量用检测试剂盒，其特征在于：所述荧光基团包括FAM、HEX、VIC、Cy5、或ROX中任意一种或至少两种的组合；

6.一种人类基因分型用的数字PCR定量试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括引物和荧光探针，所述引物和荧光探针用于扩增至少一组位点组合，所述位点组合如下：

7.据权利要求6所述的人类基因分型用的数字PCR定量试剂盒，其特征在于：所述位点组合还包括如下：

8.一种人类基因分型方法，其特征在于：所述方法是采用权利要求1～7任一项所述的试剂盒对如下DNA序列多态性位点组合进行检测：rs71854214、rs71806826、rs148026204、rs11279479、rs112182521、rs72500714、rs11276661、rs143682014、rs71752266、rs139629754、rs141415483、rs112735629、rs141566886和/或rs139197112；

9.一种个体化dd-cfDNA检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

10.根据权利要求9所述的个体化dd-cfDNA检测方法，其特征在于，其中：

11.根据权利要求9所述的个体化dd-cfDNA检测方法，其特征在于：所述步骤二中dd-cfDNA的含量的具体计算方法如下：

...

【技术特征摘要】

1.一种人类基因分型定量用检测试剂盒，其特征在于：包括用于扩增dna序列多态性位点的荧光探针或引物对；所述dna序列多态性位点包括rs71854214、rs71806826、rs148026204、rs11279479、rs112182521、rs72500714、rs11276661、rs143682014中的至少一种；

2.根据权利要求1所述的人类基因分型定量用检测试剂盒，其特征在于：包括用于扩增dna序列多态性位点的荧光探针和引物对；所述dna序列多态性位点包括rs71854214、rs71806826、rs148026204、rs11279479、rs112182521、rs72500714、rs11276661和rs143682014。

3.根据权利要求1所述的人类基因分型定量用检测试剂盒，其特征在于：所述dna序列多态性位点还包括rs71752266、rs139629754、rs141415483、rs112735629、rs141566886和rs139197112中的至少一种；

4.根据权利要求1～3任一项所述的人类基因分型定量用检测试剂盒，其特征在于：所述荧光探针的5’端含有荧光基团，3’端含有淬灭基团。

5.根据权利要求4所述的人类基因分型定量用检测试剂盒，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：巫丽娟，殷赛福，范钰，林涛，周娟，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：

全部详细技术资料下载我是这个专利的主人