一种针对低浓度核酸的文库构建方法及其在制备检测诊断试剂中的应用技术

本发明专利技术涉及一种针对低浓度核酸的文库构建方法制备检测诊断试剂中的应用，属于生物分子技术领域。本发明专利技术的方法，在低浓度的DNA中加入特定DNA片段后进行文库构建，再利用针对所述特定DNA片段设计的sgRNA和CRISPR/Cas9系统去除文库中的特定DNA片段。本发明专利技术利用先投入特定的DNA片段来解决建库起始浓度低的问题，建库后又结合CRISPR/Cas系统除去投入的序列，提高了目标序列的数据占比；操作简单，有效解决了低浓度DNA文库构建时，失败率高，接头自连率高，背景核酸序列占比高等问题；特别适合应用于病原宏基因组测序中的低浓度核酸样本，在有限的测序数据量下，提高靶标序列的检出。提高靶标序列的检出。提高靶标序列的检出。

【技术实现步骤摘要】
一种针对低浓度核酸的文库构建方法及其在制备检测诊断试剂中的应用


[0001]本专利技术涉及一种针对低浓度核酸的文库构建方法制备检测诊断试剂中的应用，属于生物分子

技术背景
[0002]随着高通量DNA测序技术，也称为二代测序技术(Next
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Generation Sequencing)的发展。其在临床上的诊断应用也越来越广泛，通过对DNA序列的分析，达到对疾病精准诊疗的目的。目前从遗传性疾病的诊断，肿瘤驱动基因突变位点的检测，再到病原宏基因组测序的应用，二代测序NGS技术在各种疾病的诊断中已经发挥着举足轻重的作用。
[0003]二代测序技术对遗传性疾病的诊断，通过测序结果分析可以发现染色体的异常和基因组的各种遗传变异，例如目前应用最广泛成熟的无创产前诊断NIPT，CNV等产品的应用，该技术在肿瘤方向的应用，对已知特定靶基因的突变检测，有利于肿瘤靶向药的选择性治疗；另外肿瘤驱动基因大panel的检测，肿瘤TMB的突变的检测是目前的肿瘤治疗和伴随诊断中最具有前景的应用方向。而最近几年来基于二代测序技术发展的mNGS即病原宏基因组测序在临床上诊断病原微生物引起感染性疾病得到了快速的发展应用。mNGS技术对病毒的序列溯源工作和全球疫情的防控都发挥着重大的作用，如SARS
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CoV
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2病毒就是通过该技术最早发现，并获得了病毒的全基因组序列，为人类迅速了解和认识SARS
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CoV
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2病毒提供了最重要的基础信息。然而在病原宏基因组检测中，由于样本类型和来源的复杂性，临床上经常会存在大量的难重复取样，核酸含量极低的样本，这些样本进行文库构建后，文库中往往会产生高比例的接头自连和无关的环境DNA序列，对文库构建的质量，测序数据量的要求和测序分析结果的有效性都提出了更大的挑战。
[0004]CRISPR/Cas系统是细菌长期进化形成的获得性免疫系统，通过酶切破坏入侵的噬菌体和外源的DNA。目前CRISPR/Cas系统已经发展成最高效，最简便，应用最广泛的基因编辑系统。CRISPR/Cas系统可以分为：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三种不同类型。其中目前应用最广基因编辑技术的CRISPR/Cas系统基本都属于Ⅱ型，例如Cas9，Cas12等。CRISPR/Cas系统主要由三部分组成，Cas蛋白和两部分RNA组件，一个crRNA和一个tracrRNA，其中的crRNA包含由CRISPR基因座转录来的核苷酸间隔序列区，tracrRNA对于一般的crRNA成熟加工以及II型监控复合体的形成是必须的。通过人工设计将这两种RNA，连接改造形成一个具有引导作用的sgRNA(single guide RNA)，Cas9蛋白在sgRNA的引导下识别靶基因PAM区，特异的切割靶位点序列，产生DNA双链断裂。目前CRISPR/Cas9技术已经成为了最快速最有效和应用最广泛的基因编辑技术。近几年来CRISPR/Cas系统在体外分子方面应用也变得越来越多，例如利用其特异性的切割活性。
[0005]宏基因组测序mNGS技术在病原体测序应用中能否获得良好的目标DNA序列数据，关键在于用于测序的文库质量，比如合适的文库大小，纯度，文库中较高的有效靶序列占比等。在对一些核酸含量极低的样本进行建库和测序时，由于建库起始的DNA浓度非常低，构
建的文库往往会产生大量接头adapter自连和大量的背景序列，这些都是无效文库序列，会产生大量的无效数据，这时候往往就需要增加测序的数据量，增加了测序的成本，而且经常也不能达到很好的测序结果。DNA浓度极低的临床样本，也会经常导致建库失败。目前对于低浓度核酸建库存在的上述问题，主要的解决方法有两个：
[0006]1)在构建文库前，对低浓度的DNA核酸进行全基因组的扩增(whole genome amplification，WGA)，以获得足够量的DNA来进行文库构建，目前该方法最主要应用在科学研究的单细胞DNA测序领域，其他科学研究和特殊的司法需求也会用到该方法扩增后再建库。但是WGA方法会对低浓度的DNA进行整体扩增，这样往往也会扩增放大样本中的背景核酸，并不能有效改善靶数据量的比例；另外WGA的过程对于临床操作相对复杂，试剂成本较高，不同WGA方法，效果也有差异，这些原因导致目前用于临床诊断的样本，特别是病原宏基因组的检测时，都不会采用该方法进行。
[0007]2)主要是从样本到核酸，再到文库构建过程中的试剂和流程进行优化，例如选择适合的微量核酸提取试剂盒，提高样本核酸得率；选择针对低浓度核酸建库性能更好的建库试剂盒，来提高构建文库的成功率和质量，该方法由于目前的提取和建库试剂盒厂家、种类繁多，很难形成统一实验预期，并且该方法本质上对低浓度核酸构建文库改善的效果是非常的有限。总体来看目前在临床上对低浓度DNA文库构建合适的解决方法还是比较欠缺，没有一个简便，经济且有效解决问题方案。

技术实现思路

[0008]本专利技术要解决上述技术问题，提供一种针对低浓度核酸的文库构建方法。本专利技术通过在低浓度的DNA中加入特定的人工合成DNA序列片段，提高文库构建的质量和成功率，再通过CRISPR/Cas9系统去除上述人工合成序列；本专利技术可以有效提高低浓度DNA建库的成功率和文库的质量。
[0009]本专利技术的技术方案如下：
[0010]一种针对低浓度核酸的文库构建方法，在低浓度的DNA中加入特定DNA片段后进行文库构建，再利用针对所述特定DNA片段设计的sgRNA和CRISPR/Cas9系统去除文库中的特定DNA片段。
[0011]本专利技术上述技术方案中，特定DNA片段可以为人工合成的片段序列；或是来源于已知质粒、其他微生物、动植物的基因组，经PCR后的片段产物；其大小范围50bp～500bp，投入量的范围0.1～10ng。并且特定DNA片段加入的步骤顺序，不但包括在DNA的片段化处理之后加入再进行文库构建；同样也包括先加入特定DNA片段，再进行DNA片段化处理和文库构建。
[0012]本专利技术通过在文库构建前，人为加入特定序列的核酸片段提高起始建库的核酸浓度，这样就避免了由于浓度低而产生的建库失败率高，接头自连率高，背景核酸序列占比高等问题。而构建好的文库中的人为投入的序列，再通过CRISPR/Cas系统切割，破坏该序列构建的文库结构，去除投入的序列，提高目的靶序列的检出占比。
[0013]本专利技术可以提高文库构建的成功率，文库质量，极大的降低文库接头自连比例。是解决目前低浓度核酸建库质量差，失败率高等问题的有效办法。并且该方法简单，快速，经济，可高通量。
[0014]本专利技术方法(SpikeCas法建库)，可以应用在所有低浓度核酸起始的文库构建，特
别是对特殊样本类型的病原宏基因组的文库质量和成功率有着显著的改善，提高靶序列的检出。
[0015]本专利技术中的CRISPR/Cas系统包括常规Cas9蛋白以及经过其他改造的过程形成的各种Cas9蛋白，也包括Cas12a，Cas12b本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种针对低浓度核酸的文库构建方法，其特征在于：在低浓度的DNA中加入特定DNA片段后进行文库构建，再利用针对所述特定DNA片段设计的sgRNA和CRISPR/Cas9系统去除文库中的特定DNA片段；所述的特定DNA片段：大小范围50bp～500bp，为人工合成的片段序列，或是来源于已知质粒、其他微生物、动植物的基因组，经PCR后的片段产物。2.根据权利要求1所述的一种针对低浓度核酸的文库构建方法，其特征在于：所述特定DNA片段加入的时机为：在片段化处理之后，或者是片段化处理之前。3.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：段昆，韩序，付雪，张莉莉，王珺，
申请(专利权)人：杭州杰毅生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：