一种用于检测HCMV的特异性探针及用于等温扩增HCMV的试剂盒制造技术

本发明专利技术设计用于检测HCMV的特异性探针及用于等温扩增HCMV的试剂盒，属于人巨细胞病毒检测技术领域。一种用于检测HCMV的特异性探针，所述探针包括包含T7启动子SEQ ID NO.32的序列和可以识别Cas13蛋白SEQ ID NO.33的序列。本发明专利技术以待测样品基因组RNA为模板，利用特异性引物探针组，进行等温扩增及CRISPR/Cas13特异性检测，根据荧光信号判定结果，实现对人巨细胞病毒感染状态的定性检测。以RNA为模板，可以区分HCMV的潜伏状态和活跃状态。可以区分HCMV的潜伏状态和活跃状态。可以区分HCMV的潜伏状态和活跃状态。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测HCMV的特异性探针及用于等温扩增HCMV的试剂盒


[0001]本专利技术设计用于检测HCMV的特异性探针及用于等温扩增HCMV的试剂盒，属于人巨细胞病毒检测


技术介绍

[0002]巨细胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）是一种疱疹病毒组DNA病毒。由于感染的细胞肿大，并具有巨大的核内包涵体，亦称细胞包涵体病毒。自然界中普遍存在，具有严格种属特异性，包括人、马、牛、猪、猫和鼠等CMV。感染人的巨细胞病毒称为人巨细胞病毒（HCMV），人疱疹5型（HHV
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5）。CMV感染小儿多表现为无症状性感染的急性感染或潜伏感染，只有少数为症状性感染，且又多发生于先天性和围生期感染患儿，感染后对孕妇和胎儿会造成严重的影响。在严重免疫缺陷时，可出现肺炎、肝炎等全身疾患。因此对CMV诊断的及时性和准确性十分重要。
[0003]目前对 CMV 感染的诊断方法多种多样。比较常见的有培养法、酶联吸附免疫法、抗原检测法、PCR定量法等。培养法是将唾液、尿液、子宫颈分泌液等标本离心沉淀，将脱落细胞用姬姆萨染色镜检，检查巨大细胞及核内和浆内嗜酸性包涵体，可作初步诊断。分离培养可将标本接种于人胚肺纤维母细胞中，由于CMV生长周期长，细胞病变出现慢，导致诊断不及时影响治疗。HCMV
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IgG和IgM是临床常用的检测指标，可间接证实体内HCMV的存在，但两者均不应用于移植前筛查，因为IgM假阳性试验可显著降低筛查的特异性，易出现假阴性和假阳性结果而造成漏诊或误诊。由于ELISAs具有快速、敏感及特异性，ELISAs已经在很大程度上取代了其他单独检测IgG和IgM的检测方法，同样因为抗体出现较迟，故不能作出早期诊断。荧光定量PCR技术灵敏度高，特异性好，并且能够快速检测，但多数荧光定量检测均是检测CMV的脱氧核糖核苷（DNA），无症状或潜伏感染者的病毒DNA均可呈阳性反应。因此，本领域亟需一种能够早期诊断HCMV活动感染的方法或试剂。

技术实现思路

[0004]本专利技术基于转录介导的扩增技术与CRISPR/Cas13特异性检测相结合的检测方法，提供了用于特异性等温扩增的引物和探针组合包括上游引物、下游引物和特异性探针。相比于目前的荧光定量PCR，本试剂盒不需要精密的荧光定量PCR仪器，扩增检测产物为RNA ，不易产生污染，特异性好，可实现对人巨细胞病毒感染状态的定性检测。
[0005]本专利技术解决上述问题的技术方案如下：一种用于检测HCMV的特异性探针，所述探针包括包含T7启动子SEQ ID NO.32的序列和可以识别Cas13蛋白SEQ ID NO.33的序列；SEQ ID NO.32：taatacgactcactataggg；SEQ ID NO.33：caaaatcaggggaagcaaaaaccccatcagatttag。
[0006]HCMV即刻早期蛋白（MIE）是分子量为72000的非结构性蛋白，其编码基因位于HCMV
长独特区，此蛋白合成出现于HCMV DNA合成之前，并启动HCMV基因表达，病毒感染数小时后可被检出。另外，MIE基因的编码序列由三个外显子组成，并且由于MIE在CMV生命周期中发挥的重要作用，长期以来一直被认为是高度保守的。因mRNA为病毒基因转录的产物，是复制活跃的标志，因此mRNA表达与活动性感染关系密切，故检测MIE基因能达到早期诊断目的。为此我们建立了用以检测HCMV复制阶段产生的即刻早期MIE基因转录物mRNA的等温扩增加CRISPR检测的方法，可辅助早期诊断HCMV活动感染。
[0007]本专利技术选择已公布的HCMV
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MIE的序列作为靶点。人巨细胞病毒（HCMV）的即刻早期基因MIE基因，它是CMV原发感染或复发感染后最先表达的基因，在CMV感染后1小时内即可出现。它不但能激活自身启动子，而且还参与调控细胞基因的转录与表达。MIE蛋白在CMV基因表达的后续调控过程中起着主导作用。所以以MIE基因作为靶点临床应用价值较高。
[0008]本研究中以MIE基因为靶基因(SEQ ID NO.30)，对其RNA核酸（SEQID NO.31）进行扩增检测，通过定性的方式来判断患者的感染状态。
[0009]作为上述技术方案的优选，所述特异性探针为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示序列中的一种；SEQ ID NO.1taatacgactcactatagggcaaaatcaggggaagcaaaaaccccatcagatttagGGCGCCCTTGCTCACATCATGCAGCTCCTSEQ ID NO.2taatacgactcactatagggcaaaatcaggggaagcaaaaaccccatcagatttagGCCCTTGCTCACATCATGCAGCTCCTTAASEQ ID NO.3taatacgactcactatagggcaaaatcaggggaagcaaaaaccccatcagatttagCTTGCTCACATCATGCAGCTCCTTAATACSEQ ID NO.4taatacgactcactatagggcaaaatcaggggaagcaaaaaccccatcagatttagCTCACATCATGCAGCTCCTTAATACAAGCSEQ ID NO.5taatacgactcactatagggcaaaatcaggggaagcaaaaaccccatcagatttagACATCATGCAGCTCCTTAATACAAGCCATSEQ ID NO.6taatacgactcactatagggcaaaatcaggggaagcaaaaaccccatcagatttagTCATGCAGCTCCTTAATACAAGCCATCCASEQ ID NO.7taatacgactcactatagggcaaaatcaggggaagcaaaaaccccatcagatttagTGCAGCTCCTTAATACAAGCCATCCACATSEQ ID NO.8taatacgactcactatagggcaaaatcaggggaagcaaaaaccccatcagatttagAGCTCCTTAATACAAGCCATCCACATCTC
SEQ ID NO.9taatacgactcactataggggcaaaatcaggggaagcaaaaaccccatcagatttagCCTTAATACAAGCCATCCACATCTCCCGCSEQ ID NO.10taatacgactcactatagggcaaaatcaggggaagcaaaaaccccatcagatttag TAATACAAGCCATCCACATCTCCCGCTTA以上crDNA在可以在T7 RNA聚合酶的作用下转录产生crRNA，可以与Cas13蛋白形成复合物，并特异性识别靶序列；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测HCMV的特异性探针，其特征在于：所述探针包括包含T7启动子SEQ ID NO.32的序列和可以识别Cas13蛋白SEQ ID NO.33的序列；SEQ ID NO.32：taatacgactcactataggg；SEQ ID NO.33：caaaatcaggggaagcaaaaaccccatcagatttag。2.根据权利要求1所述的一种用于检测HCMV的特异性探针，其特征在于：特异性探针为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示序列中的一种；SEQ ID NO.1taatacgactcactatagggcaaaatcaggggaagcaaaaaccccatcagatttagGGCGCCCTTGCTCACATCATGCAGCTCCTSEQ ID NO.2taatacgactcactatagggcaaaatcaggggaagcaaaaaccccatcagatttagGCCCTTGCTCACATCATGCAGCTCCTTAASEQ ID NO.3taatacgactcactatagggcaaaatcaggggaagcaaaaaccccatcagatttagCTTGCTCACATCATGCAGCTCCTTAATACSEQ ID NO.4taatacgactcactatagggcaaaatcaggggaagcaaaaaccccatcagatttagCTCACATCATGCAGCTCCTTAATACAAGCSEQ ID NO.5taatacgactcactatagggcaaaatcaggggaagcaaaaaccccatcagatttagACATCATGCAGCTCCTTAATACAAGCCATSEQ ID NO.6taatacgactcactatagggcaaaatcaggggaagcaaaaaccccatcagatttagTCATGCAGCTCCTTAATACAAGCCATCCASEQ ID NO.7taatacgactcactatagggcaaaatcaggggaagcaaaaaccccatcagatttagTGCAGCTCCTTA...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖丽娜，斯叶琦，高晓庆，方昭青，刘莉莉，韩序，王珺，
申请(专利权)人：杭州杰毅生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：