一种检测猪流行性腹泻、传染性胃肠炎和丁型冠状病毒的三重RT-PCR引物组及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种检测猪流行性腹泻、传染性胃肠炎和丁型冠状病毒的三重RT

【技术实现步骤摘要】
一种检测猪流行性腹泻、传染性胃肠炎和丁型冠状病毒的三重RT
‑
PCR引物组及其应用


[0001]本专利技术涉及生化检测
，具体涉及一种检测猪流行性腹泻、传染性胃肠炎和丁型冠状病毒的三重RT
‑
PCR引物组及其应用。

技术介绍

[0002]病毒性腹泻是困扰养猪业的一大难题。临床上以猪流行性腹泻病毒感染引起的病毒性腹泻最为常见，且常伴有多种腹泻病原的混合感染，这些常见病原包括猪传染性胃肠炎病毒和猪丁型冠状病毒等。猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(P.transmissible gastroenteritis virus，TGEV)和猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)均属于冠状病毒科的成员，其临床症状和病理变化极为相似，仅通过简单的临床症状辨别难以有效区分。且有研究显示，猪丁型冠状病毒是一种新型的人畜共患病原，这些病原的混合感染给临床腹泻病原诊断带来巨大挑战，其防控也具有重要的公共卫生意义。目前临床上鉴别这3种疾病的传统方法有临床观察、病毒分离、显微病变观察、荧光抗体检测、免疫组织化学法等。因为PEDV，TGEV和PDCoV感染仔猪后引起的临床症状和病理变化非常相似，依赖临床观察和显微病变观察不能有效区分；免疫组织化学法和荧光抗体法具有较强的非特异性；而病毒分离周期较长，且这3种病毒只能感染一些特定的细胞。因此，建立一种同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪丁型冠状病毒的快速、准确的检测方法迫在眉睫。
[0003]多重qPCR检测技术，可在一个反应管中同时检测并定量分析多种病原，在临床多种病原混合感染的情况下进行病原快速区分优势明显，与单重qPCR相比，大大降低了检测过程中的材料成本和人力成本。然而建立一个有效的多重qPCR检测方法并非易事，由于多重qPCR反应体系中同时存在多种引物和探针对，如何保障引物和探针序列的特异性，避免出现非特异性扩增是多重qPCR检测技术面临的一大挑战。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于针对猪流行性腹泻病毒M基因、猪传染性胃肠炎病毒基因S和猪丁型(德尔塔)冠状病毒M基因，筛选保守区域设计特异性引物探针，建立了猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪丁型冠状病毒的三重荧光定量qPCR检测方法，可快速准确确诊临床腹泻的感染病原，有效指导腹泻防控。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪丁型冠状病毒的三重荧光定量PCR引物组，包括用于检测猪流行性腹泻病毒的引物及TaqMan探针的核苷酸序列如下：
[0007]PEDV
‑
F如SEQ ID NO.1所示；
[0008]PEDV
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R如SEQ ID NO.2所示；
[0009]PEDV
‑
probe如SEQ ID NO.3所示；
[0010]用于检测猪传染性胃肠炎病毒的引物及TaqMan探针的核苷酸序列如下：
[0011]TGEV
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F如SEQ ID NO.4所示；
[0012]TGEV
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R如SEQ ID NO.5所示；
[0013]TGEV
‑
probe如SEQ ID NO.6所示；
[0014]用于检测猪丁型冠状病毒的引物及TaqMan探针的核苷酸序列如下：
[0015]PDCoV
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F如SEQ ID NO.7所示；
[0016]PDCoV
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R如SEQ ID NO.8所示；
[0017]PDCoV
‑
probe如SEQ ID NO.9所示。
[0018]优选地，所述探针的5
’
端分别修饰不同的荧光基团，3
’
端分别修饰不同的淬灭基团。
[0019]优选地，所述荧光基团为CY5、ROX和FAM，所述淬灭基团为BHQ1和BHQ2。
[0020]本专利技术提供了一种同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪丁型冠状病毒的三重荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包含如上述所述引物组。
[0021]优选地，所述试剂盒还包括热启动Taq DNA聚合酶、反转录酶、无酶水、PCR反应液、配套Buffer、对照品。
[0022]优选地，所述对照品包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为带有猪流行性腹泻病毒M基因、猪传染性胃肠炎病毒S基因和猪丁型冠状病毒M串联基因片段的阳性重组质粒标准品模板，所述阴性对照为pUC57空载体。
[0023]优选地，所述串联基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
[0024]本专利技术提供了一种同时检测猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒和丁型冠状病毒的三重荧光定量PCR检测体系，以25μL总体积反应体系计，包括2
×
One Step RT
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PCR Buffer III 12.5μL，5U Takara Ex Taq HS 0.5μL，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.5μL，浓度分别为0.4μmol/L的PEDV
‑
F、PEDV
‑
R、TGEV
‑
F、TGEV
‑
R各0.8μL，浓度分别为0.3μmol/L PDCoV
‑
F、PDCoV
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R各0.6μL，浓度分别为0.15μmol/L的PEDV
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probe和TGEV
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probe各0.3μL，浓度为0.1μmol/L PDCoV
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probe 0.2μL，模板1μL、无核酶水加至25μL。
[0025]本专利技术提供了一种非诊断目的同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪德尔塔冠状病毒的三重荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：提取肛拭子样品、腹泻粪便样品或消化道组织的总RNA，使用所述引物组，或所述试剂盒，或所述检测体系进行PCR扩增，收集荧光信号；根据机器测算的荧光信号及Ct值判断样品中是否有PEDV、TGEV、PDCoV荧光信号，Ct＞35判定可疑，需重检。
[0026]优选地，所述反应程序如下：荧光通道设置为：通道1：FAM，通道2：ROX，通道3：CY5；反应条件为：42℃、5min，95℃、10s；95℃、5s，50.5℃、30s，35℃、30s，扩增35～40个循环。
[0027]与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：
[0028](1)本专利技术的试剂盒，能够在一个PCR反应管中同时进行猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎及猪丁型冠状病毒的检测，为这三种病原的检测提供了一种简便、高效和低成本的方法。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测猪流行性腹泻、传染性胃肠炎和丁型冠状病毒的三重RT
‑
PCR引物组，其特征在于：包括用于检测猪流行性腹泻病毒的引物及TaqMan探针的核苷酸序列如下：PEDV
‑
F如SEQ ID NO.1所示；PEDV
‑
R如SEQ ID NO.2所示；PEDV
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probe如SEQ ID NO.3所示；用于检测猪传染性胃肠炎病毒的引物及TaqMan探针的核苷酸序列如下：TGEV
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F如SEQ ID NO.4所示；TGEV
‑
R如SEQ ID NO.5所示；TGEV
‑
probe如SEQ ID NO.6所示；用于检测猪丁型冠状病毒的引物及TaqMan探针的核苷酸序列如下：PDCoV
‑
F如SEQ ID NO.7所示；PDCoV
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R如SEQ ID NO.8所示；PDCoV
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probe如SEQ ID NO.9所示。2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述探针的5
’
端分别修饰不同的荧光基团，3
’
端分别修饰不同的淬灭基团。3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述荧光基团为CY5、ROX和FAM，所述淬灭基团为BHQ1和BHQ2。4.一种检测猪流行性腹泻、传染性胃肠炎和丁型冠状病毒的三重RT
‑
PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1～3任意一项所述引物组。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括热启动Taq DNA聚合酶、反转录酶、无酶水、PCR反应液、配套Buffer、对照品。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述对照品包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为带有猪流行性腹泻病毒M基因、猪传染性胃肠炎病毒S基因和猪丁型冠状病毒M串联基因片段的阳性重组质粒标准品模板，所述阴性对照为pUC57空载体。7.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：李艳，翟少伦，李春玲，周霞，廖明，张建峰，魏文康，张昆丽，勾红潮，楚品品，杨冬霞，
申请(专利权)人：广东省农业科学院农业生物基因研究中心，
类型：发明
国别省市：