牛病毒性腹泻病毒RT-RAA检测体系及侧流层析检测方法技术

本发明专利技术涉及一种牛病毒性腹泻病毒RT

【技术实现步骤摘要】
牛病毒性腹泻病毒RT
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RAA检测体系及侧流层析检测方法


[0001]本专利技术属于动物分子生物学领域，特别涉及一种牛病毒性腹泻病毒RT
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RAA检测体系及侧流层析检测方法。

技术介绍

[0002]牛病毒性腹泻/黏膜病是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV) 引起的一种持续性免疫耐受性疾病，是世界范围内牛的重要病原体。其感染可导致多系统临床症状，如消化系统、生殖系统、呼吸系统等。其特殊性在于胎牛在子宫内感染该病毒，可导致出生犊牛的BVDV持续性感染，并伴随免疫耐受，造成了养殖户的重大的经济损失。该病可导致免疫耐受持续感染(Persistent infection，PI)的产生和病毒的传播。牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)为该病的病原，在黄病毒科的瘟病毒属中，BVDV是一种单链RNA病毒。根据遗传和抗原特征，主要分为BVDV
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1BVDV
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2。
[0003]出于经济和动物健康的原因，越来越多的国家实施了BVDV根除项目，主要的重点是发现和清除持续感染的牛。迄今为止，针对牛病毒性腹泻黏膜病还未研发有效疫苗和抗病毒药物，并且确诊BVDV操作技术繁琐，费用高昂，鉴定时间过长会严重影响该病防控的时效性。重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase aided amplification，RAA)是我国自主研发并申请专利的等温核酸快速检测技术，其扩增产物可通过侧流层析试纸条法进行快速检测(Lateral flow dipstick，LFD)。本专利技术旨在建立对BVDV
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1与BVDV
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2 的RT
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RAA
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LFD检测方法，为临床检测BVDV提供新方法和依据。

技术实现思路

[0004]本专利技术的第一目的是提供一种牛病毒性腹泻病毒RT
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RAA检测体系，克服目前尚无有效、快速的检测BVDV病毒的体系。
[0005]本专利技术的第二目的是提供利用上述体系检测BVDV病毒的检测方法。
[0006]本专利技术通过以下技术方案来实现：
[0007]一、一种牛病毒性腹泻病毒RT
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RAA检测体系，包括BVDV RNA模板5μL，上游引物2μL，下游引物2μL，探针2μL，A buffer 25μL，反应干粉一管，ddH2O 13.5 μL，B buffer 2.5μL，其中，所述的上游引物为检测BVDV1型的上游引物或检测BVDV2 型的上游引物，下游引物为检测BVDV2型的下游引物或检测BVDV2型的下游引物，探针为检测BVDV1型探针或者检测BVDV2型探针。
[0008]进一步的，检测BVDV1型的上游引物和下游引物序列如下：
[0009]BVDV1F：TGCCCTTAGTAGGACTAGCAAAATGAG(SEQ ID No.1)；
[0010]BVDV1R：CATGTACAGCAGAGATTTTTAGTAGC(SEQ ID No.2)；
[0011]检测BVDV2型的上游引物和下游引物序列如下：
[0012]BVDV2F：GCCCTTAGTAGGACTAGCAAAAAGAG(SEQ ID No.3)；
[0013]BVDV2R：GCTGTGTTCATAACACCACAAAATGGT(SEQ ID No.4)。
[0014]进一步的，探针序列如下：
[0015]BVDV1：TGGTGAGTTCGTTGGATGGCTGAAGCCCTGGTACAGGGTAG(SEQIDNo.5)；
[0016]BVDV2：AGCGGTAGCAGTGAGTTCATTGGATGGCCGATCCCTGAGTACAG(SEQIDNo.6)。
[0017]二、一种根据上述的牛病毒性腹泻病毒RT
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RAA检测体系的侧流层析检测方法，该方法包括以下步骤：
[0018](1)上游引物、下游引物、探针、水、Abuffer混合均匀后加入到反应干粉管中；
[0019](2)向检测管中加入5μLRNA，在向检测管中加入2.5μL的Bbuffer；
[0020](3)盖上管盖，上下颠倒混匀，瞬时离心；
[0021](4)将检测管放入金属浴仪器上，温度设置在42℃，时间为30min；
[0022](5)反应结束后，将反应产物稀释15倍，抽取10μL反应产物放入140μL稀释液，混匀后将100μL混合液滴加在试纸条上，等待5min观察结果并记录拍照结果。
[0023]采用上述技术方案的积极效果：本专利技术成功建立了BVDV
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1和BVDV
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2的RT
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RAA
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LFD快速检测方法，可以在30min检测出BVDVRNA，且特异性、敏感性、重复性良好，其中，BVDV1型的检测结果与国标RT
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qPCR方法的符合率高达99％，适用于BVDV1型和2型的临床快速、可视化检测。
附图说明
[0024]图1是BVDV感染MDBK细胞后的效果图，其中，(A)未接毒的MDBK细胞(B)BVDV1型接毒48h(C)BVDV2型接毒48h；
[0025]图2是BVDV1RT
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RAA反应体系上游引物的筛选图，其中，M：DL2000DNAMarker；1：F1+R1；2：F2+R1；3：F3+R1；4：F4+R1；
[0026]图3是BVDV1RT
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RAA反应体系下游引物的筛选图，其中，M：DL2000DNAMarker；1：F1+R1；2：F1+R2；3：F1+R3；4：F1+R4；
[0027]图4是BVDV2RT
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RAA反应体系上游引物的筛选图，其中，M：DL2000DNAMarker；1：F1+R1；2：F2+R1；3：F3+R1；4：F4+R1；
[0028]图5是BVDV2RT
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RAA反应体系下游引物的筛选图，其中，M：DL2000DNAMarker；1：F1+R1；2：F1+R2；3：F1+R3；4：F1+R4；
[0029]图6是BVDV1RT
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RAA荧光法验证探针结果图；
[0030]图7是BVDV2RT
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RAA荧光法验证探针结果图；
[0031]图8是BVDV1RT
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RAA
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LFD方法的建立，其中，1：阳性对照；2：加水的阴性对照；
[0032]图9是BVDV2RT
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RAA
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LFD方法的建立，其中，1：阳性对照；2：加水的阴性对照；
[0033]图10是BVDV1RT
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...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牛病毒性腹泻病毒RT
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RAA检测体系，其特征在于：包括BVDV RNA模板5μL，上游引物2μL，下游引物2μL，探针2μL，A buffer 25μL，反应干粉一管，ddH2O 13.5μL，B buffer 2.5μL，其中，所述的上游引物为检测BVDV1型的上游引物或检测BVDV2型的上游引物，下游引物为检测BVDV2型的下游引物或检测BVDV2型的下游引物，探针为检测BVDV1型探针或者检测BVDV2型探针。2.根据权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒RT
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RAA检测体系，其特征在于：检测BVDV1型的上游引物和下游引物序列如下：BVDV1F：TGCCCTTAGTAGGACTAGCAAAATGAG(SEQ ID No.1)；BVDV1R：CATGTACAGCAGAGATTTTTAGTAGC(SEQ ID No.2)；检测BVDV2型的上游引物和下游引物序列如下：BVDV2F：GCCCTTAGTAGGACTAGCAAAAAGAG(SEQ ID No.3)；BVDV2R：GCTGTGTTCATAACACCACAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈楠楠，李阳，金鑫，朱战波，刘宇，尹革芬，
申请(专利权)人：黑龙江八一农垦大学，
类型：发明
国别省市：