高灵敏高特异的多重RNA病毒核酸检测方法技术

本发明专利技术公开一种高灵敏高特异的多重RNA病毒核酸检测新方法，该方法包括两个部分：逆转录反应，即将RNA逆转录为cDNA，和FEN1辅助的RPA扩增检测反应，即高灵敏度的RPA扩增反应偶联高特异性的核酸侵入反应，简称FARPA，通过在逆转录引物上引入RPA通用引物的序列合成cDNA二链，再采用通用引物进行多重RPA扩增，并偶联FEN1催化的级联核酸侵入反应同时检测多重扩增产物。本发明专利技术的新方法准确、灵敏度高、特异性好，可以在50分钟内同时检测多种RNA核酸靶标，非常适用于SARS

【技术实现步骤摘要】
高灵敏高特异的多重RNA病毒核酸检测方法


[0001]本专利技术涉及一种高灵敏高特异的多重RNA病毒核酸检测方法，属于核酸检测


技术介绍

[0002]核酸检测(Nucleic acid testing,NAT)具有灵敏、快速、可自动化等优点，对疫情的控制和疾病进展的监测具有重要意义。
[0003]重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)是一种等温DNA扩增技术，与其他等温扩增方法不同，RPA的反应温度为37～42℃，非常接近室温，仅需简单的仪器如水浴锅。由于灵敏、快速、对仪器要求低等优势，RPA技术已广泛应用于病原体的检测。
[0004]商品化RPA试剂盒通常采用探针法(如exo探针)检测扩增产物，当探针和扩增产物之间形成双链进而引发核酸酶切割探针时产生荧光信号。除了探针需要3'末端封闭、中间引入四氢呋喃(THF)修饰位点、THF临近处5'端修饰荧光基团且3'端修饰淬灭基团，制备成本较高外，由于核酸外切酶III也能随机切割引物和探针形成的非特异性二聚体，产生假阳性信号，特异性较差；因此，激活核酸外切酶III的醋酸镁需要最后加入(通常是将醋酸镁添加到管盖的内表面再离心启动反应)。虽然这一步并不复杂，但无需控制试剂加入顺序同时将所有试剂添加到反应混合物中可简化操作。
[0005]另一种检测RPA扩增产物的方法是用CRISPR
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Cas13a附带切割非特异性RNA报告分子(称为SHERLOCK技术)，但还需要通过T7 RNA聚合酶将RPA扩增产物体外转录为RNA。这一额外步骤可以通过使用CRISPR
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Cas12a直接切割DNA报告分子(称为DETECTR技术)来简化；但由于CRISPR
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Cas与RPA这两个反应体系不兼容，必须先进行RPA扩增后开管采用CRISPR
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Cas系统检测。
[0006]此外，基于exo探针和CRISPR
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Cas的RPA检测方法，其特异性仅依赖于扩增产物与exo探针之间或扩增产物(或体外转录产物)与向导分子之间形成双链所触发的切割探针或报告分子，而在接近室温(37～42℃)下，易发生碱基错配形成非特异性双链导致假阳性结果。
[0007]针对以上问题，本课题组已开发了一种高特异RPA/RAA检测试剂盒及检测方法(详见专利申请号“202110664764.0”)，但该方法只能进行单管单重DNA检测，即一次反应只能检测一种DNA靶标，而在实际应用中，为了准确地检测病原体，大多数情况下至少应该检测两个靶标(一个内参基因和一个感兴趣的病原体基因)。例如，在单管中进行多重PCR同时检测N(或S)基因和/或开放阅读框1ab(ORF1ab)以及看家基因(作为内参)，以筛查是否感染新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)。因此，可同时检测多重RPA产物的方法亟需开发。
[0008]由于重组酶对DNA序列具有一定的偏好性，且不同靶标的多种引物与重组酶、DNA聚合酶、单链结合蛋白之间存在一定的竞争导致不同靶标的扩增效率完全不同，需要精心设计筛选各靶标的RPA引物序列并优化引物浓度才可能实现两重RPA扩增。为此，我们开发
了一种高灵敏高特异的多重RNA病毒核酸检测新方法，包括逆转录反应和FEN1辅助的RPA扩增检测反应(简称FARPA)。该方法可同时检测新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)的多个靶基因及其他RNA病毒，解决了RPA反应难以进行多重扩增和检测的难题。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供一种高灵敏高特异的多重RNA病毒核酸检测的新方法。
[0010]本专利技术的目的通过以下技术方案实现：
[0011]一种高灵敏高特异的多重RNA病毒核酸检测方法，其特征在于其步骤包括：
[0012](1)逆转录反应：以待测样品为模板，加入一对逆转录引物进行逆转录反应，获得cDNA二链，所述逆转录引物由5'端的RPA通用引物序列和3'端的核酸靶标特异性序列两部分组成；
[0013](2)多重RPA扩增反应，并偶联级联核酸侵入反应：以cDNA二链为模板，加入一对RPA通用引物、上游探针、下游探针、发夹探针，在酶的作用下，控制温度先进行多重RPA反应以扩增核酸模板，再提高温度进行级联核酸侵入反应；
[0014]所述的上游探针其3'末端最后一个碱基与核酸靶标错配，其余的序列与核酸靶标互补，并且熔解温度高于核酸侵入反应的温度，与互补的核酸靶标稳定地结合；所述的下游探针其5'有一段与核酸靶标不互补的翘起序列，称为flap片段，其余的序列与核酸靶标互补，并且熔解温度接近核酸侵入反应的温度，在核酸侵入反应中能与核酸靶标结合和解离；
[0015]所述的发夹探针是具有荧光共振能量转移的探针，其5'端修饰了荧光基团和淬灭基团，且两者间隔1～6个碱基，flap核酸内切酶的识别位点在间隔碱基上，其3'端序列与不同下游探针对应的flap片段互补，用于检测不同的核酸靶标。
[0016]优选的，步骤(2)中使用的酶为DNA聚合酶、重组酶、flap核酸内切酶，还包括单链DNA结合蛋白。
[0017]优选的，荧光基团为FAM、VIC或Cy5，淬灭基团为BHQ1或BHQ2。
[0018]优选的，所述flap核酸内切酶为Afu FEN1，具有单碱基差异的识别能力，能够特异性地识别并切割由上游探针、下游探针和核酸靶标形成的三碱基重叠结构，或flap片段与发夹探针形成的三碱基重叠结构，从而将靶标检测转换为通用的flap片段检测。
[0019]优选的，步骤(1)中使用HiScriptⅡ或PrimeScriptⅡ逆转录酶进行逆转录反应，同时还添加有Taq DNA聚合酶和RNase抑制剂。
[0020]优选的，步骤(1)中逆转录反应条件为50℃6min，95℃1min，55℃1min，72℃1min。
[0021]优选的，步骤(2)中的DNA聚合酶为具有链置换活性的DNA恒温扩增聚合酶，所述的重组酶为T4 UvsX和T4 UvsY蛋白，所述的单链DNA结合蛋白为T4 gp32蛋白。
[0022]优选的，步骤(2)中多重RPA反应的温度为37～42℃，时间为10～30min；步骤(2)中级联核酸侵入反应温度为60～63℃，时间为1～20min。
[0023]本专利技术的反应过程及原理为：将待测样本的RNA逆转录成cDNA二链，然后控制温度先进行多重RPA扩增核酸模板，在该步骤中，重组酶与RPA通用引物结合，形成酶
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引物复合体，复合体定位到各靶标上，在单链DNA结合蛋白的协助下，双链靶标DNA解链，随后在具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，并随着反应时间的延长产物量不断积累；再调整温度进行FEN1催化的级联核酸侵入反应，在该步骤中，上游探针及下游探针本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高灵敏高特异的多重RNA病毒核酸检测方法，其特征在于其步骤包括：(1)逆转录反应：以待测样品为模板，加入一对逆转录引物进行逆转录反应，获得cDNA二链，所述逆转录引物由5
′
端的RPA通用引物序列和3
′
端的核酸靶标特异性序列两部分组成；(2)多重RPA扩增反应，并偶联级联核酸侵入反应：以cDNA二链为模板，加入一对RPA通用引物、上游探针、下游探针、发夹探针，在酶的作用下，控制温度先进行多重RPA反应以扩增核酸模板，再提高温度进行级联核酸侵入反应；所述的上游探针其3
′
末端最后一个碱基与核酸靶标错配，其余的序列与核酸靶标互补，并且熔解温度高于核酸侵入反应的温度，与互补的核酸靶标稳定地结合；所述的下游探针其5
′
端有一段与核酸靶标不互补的翘起序列，称为flap片段，其余的序列与核酸靶标互补，并且熔解温度接近核酸侵入反应的温度，在核酸侵入反应中能与核酸靶标结合和解离；所述的发夹探针是具有荧光共振能量转移的探针，其5
′
端修饰了荧光基团和淬灭基团，且两者间隔1～6个碱基，flap核酸内切酶的识别位点在间隔碱基上，其3
′
端序列与不同下游探针对应的flap片段互补，用于检测不同的核酸靶标。2.根据权利要求1所述的高灵敏高特异的多重RNA病毒核酸检测方法，其特征在于：步骤(2)中使用的酶为DNA聚合酶、重组酶、flap核酸内切酶，还包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：周国华，马漪，武海萍，马雪萍，
申请(专利权)人：中国人民解放军东部战区总医院，
类型：发明
国别省市：