用于检测新型冠状病毒及区分Omicron不同突变株的引物探针组合和试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及病毒检测技术领域，具体涉及用于检测新型冠状病毒及区分Omicron不同突变株的引物探针组合和试剂盒。本发明专利技术提供的用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合能够实现双管多重PCR检测新型冠状病毒并区分鉴别突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X；具有较高的灵敏度，能够满足临床实践中对于新型冠状病毒核酸检测灵敏度的要求，同时具有较高的特异性和准确性。性。

【技术实现步骤摘要】
用于检测新型冠状病毒及区分Omicron不同突变株的引物探针组合和试剂盒


[0001]本专利技术涉及病毒检测
，尤其涉及用于检测新型冠状病毒及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合和试剂盒。

技术介绍

[0002]目前新型冠状病毒(COVID
‑
19，SARS
‑
CoV
‑
2)Omicron变异株仍是全球优势株。Omicron变异株主要包括BA.1、BA.2、BA.3、BA.4和BA.5。截止至2022年9月19日，WHO的每周新冠病毒流行更新报告显示，BA.2.X(含BA.2.75.X)在全球占比1.91％；BA.4.X在全球占比7.53％；BA.5.X在全球占比83.83％(含新变体BA.5.1+V445、BA.5.2+K444、BA.5.2.1+K444、BA.5.2.1+R346、BE.1.1)。在全球范围内，从2022年8月19日至9月19日，通过GISAID共享了120617个SARS
‑
CoV
‑
2序列，其中，有119458条序列为Omicron关注变异(VOC)，占已报道序列的99.0％。既往研究显示Omicron BA.2的传染性大约是BA.1的1.4倍，BA.4和BA.5的传染性比BA.2高约36％。据相关研究显示，室数据表明疫苗免疫产生的中和抗体在阻断BA.4.X和BA.5.X效果方面不如阻断早期Omicron病毒株(包括BA.1.X和BA.2.X)有效。这可能使接种过疫苗和加强免疫的人也容易对多种Omicron变异株亚型易感。即使是因接种疫苗和先前感染Omicron BA.1.X而具有混合免疫力的人，也会产生难以使BA.4.X和BA.5.X丧失能力的抗体。南非的一项研究显示，相比于之前感染Omicron原始株BA.1的人，未接种疫苗的人感染BA.4或BA.5产生血液中和抗体下降了近8倍，而接种疫苗的人下降了约3倍。BA.4和BA.5传染性的增加使得这两个亚型可能会取代之前的BA.1、BA.2和BA.3亚型，并可能成为Omicron变异株新的主导亚型。
[0003]然而，目前尚无试剂盒可以检测新型冠状病毒并区分BA.4.X、BA.2.X、BA.5.X突变株，因此，亟需开发能够检测新型冠状病毒以及区分BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X突变株的引物探针组合及试剂盒。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供用于检测新型冠状病毒及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合和试剂盒。
[0005]本专利技术对GISAID数据库收录的截止目前所有的BA.5.X、BA.2.X以及BA.4.X的新冠突变株的核苷酸序列进行序列对比，筛选确定了具有BA.5.X、BA.2.X、BA.4.X突变株区分意义的位点，包括S基因突变位点HV69/70del、L452R、F486V、Q493R，ORF1a基因突变位点L3201F，N基因突变位点P151S(各突变位点的序列比对示意图如图1、图2所示)；通过在S基因突变位点的基础上进一步引入ORF1a基因突变位点L3201F和N基因突变位点P151S进行突变株BA.4.X、BA.2.X、BA.5.X的区分，显著增加了特异性。针对上述位点设计多重特异性引物，利用多重PCR检测上述4个S基因突变位点、1个ORF1a基因突变位点和1个N基因突变位点，实现新型冠状病毒BA.2.X、BA.4.X、BA.5.X的突变株的区分鉴别。
ID NO.15
‑
16所示的引物和序列如SEQ ID NO.17所示的探针；
[0035]第六引物探针组，用于检测新型冠状病毒N基因保守区域，其包括序列如SEQ ID NO.18
‑
19所示的引物和序列如SEQ ID NO.20所示的探针。
[0036]其中，序列如SEQ ID NO.15所示的引物为ORF1ab基因保守序列的上游引物；序列如SEQ ID NO.16所示的引物为ORF1ab基因保守序列的下游引物；ORF1ab基因保守序列的探针的序列如SEQ ID NO:17所示；
[0037]序列如SEQ ID NO.18所示的引物为N基因保守序列的上游引物；序列如SEQ ID NO.19所示的引物为N基因保守序列的下游引物；N基因保守序列的探针的序列如SEQ ID NO:20所示。
[0038]优选地，ORF1ab、N基因保守序列采用普通TaqMan探针法检测。
[0039]上述序列如SEQ ID NO.17、20所示的探针为普通TaqMan探针。探针的5
′
端包含荧光基团标记，所述荧光基团标记可选自FAM、HEX、ROX、CY5中的一种；探针的3
′
端含有淬灭基团标记，所述淬灭基团标记可选自BHQ1、BHQ2中的一种。
[0040]基于上述引物探针组合，并结合ARMS
‑
PCR、TaqMan
‑
MGB探针和普通TaqMan探针技术，本专利技术实现了双管多重PCR检测新型冠状病毒ORF1ab和N基因保守序列以及4个S基因突变位点、1个ORF1a基因突变位点、1个N基因突变位点，进而实现了新型冠状病毒的检测以及突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的鉴别。
[0041]优选地，上述引物探针组合在进行新型冠状病毒的检测以及突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的区分时，分两管进行多重PCR扩增，其中一管使用序列如SEQ ID NO.1
‑
8所示的引物和探针进行扩增，另一管使用序列如SEQ ID NO.9
‑
23所示的引物和探针进行扩增。
[0042]第三方面，本专利技术提供以上所述的用于区分新型冠状病毒突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合或所述用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合在制备用于检测新型冠状病毒和/或区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的试剂盒中的应用。
[0043]本专利技术提供所述用于区分新型冠状病毒突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合在制备用于区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的试剂盒中的应用。
[0044]本专利技术提供所述用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合在制备用于检测新型冠状病毒并区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的试剂盒中的应用
[0045]第四方面，本专利技术提供一种试剂盒，所述试剂盒包含以上所述的用于区分新型冠状病毒突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合，或者，所述试剂盒包含所述的用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合。
[0046]优选地，所述试剂盒中，各引物的工作浓度为0.1...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于区分新型冠状病毒突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括：第一引物探针组，用于检测S基因突变位点HV69/70del，其包括序列如SEQ ID NO.1
‑
2所示的引物和序列如SEQ ID NO.3所示的探针；第二引物探针组，用于检测S基因突变位点L452R、F486V、Q493R，其包括序列如SEQ ID NO.4
‑
5所示的引物和序列如SEQ ID NO.6
‑
8所示的探针；第三引物探针组，用于检测ORF1a基因突变位点L3201F，其包括序列如SEQ ID NO.9
‑
10所示的引物和序列如SEQ ID NO.11所示的探针；第四引物探针组，用于检测N基因突变位点P151S，其包括序列如SEQ ID NO.12
‑
13所示的引物和序列如SEQ ID NO.14所示的探针。2.根据权利要求1所述的用于区分新型冠状病毒突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合还包括内参引物探针组；所述内参引物探针组用于扩增人内源性基因B2M RNA，包括序列如SEQ ID NO.21
‑
22所示的引物和序列如SEQ ID NO.23所示的探针。3.根据权利要求1或2所述的用于区分新型冠状病毒突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合，其特征在于，序列如SEQ ID NO.3、11、14、23所示的探针为普通TaqMan探针，序列如SEQ ID NO.6
‑
8所示的探针为TaqMan
‑
MGB探针。4.用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括用于检测新型冠状病毒的引物探针组合以及权利要求1～3任一项所述的用于区分新型冠状病毒突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合。5.根据权利要求4所述的用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合，其特征在于，所述用于检测新型冠状病毒的引物探针组合包括：第五引物探针组，用于检测新型冠状病毒ORF1ab基因保守区域，其包括序列如SEQ ID NO.15
‑
16所示的引物和序列如SEQ ID NO.17所示的探针；第六引物探针组，用于检测新型冠状病毒N基因保守区域，其包括序列如SEQ ID NO.18
‑
19所示的引物和序列如SEQ ID NO.20所示的探针。6.根据权利要求5所述的用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合，其特征在于，序列如SEQ ID NO.17、20所示的探针为普通TaqMan探针。7.权利要求1～3任一项所述的用于区分新型冠状病毒突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合或权利要求4～6任一项所述的用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合在制备用于检测新型冠状病毒和/或区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的试剂盒中的应用。8.试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1～3任一项所述的用于区分新型冠状病毒突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合或包含权利要求4～6任一项所述的用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X的引物探针组合；优选地，所述试剂盒中，各引物的工作浓度为0.1
‑
0.5μM；各探针的工作浓度为0.1
‑
0.3μM；更优选地，所述试剂盒还包含选自PCR酶系、PCR反应预混液、阳性质控品和阴性质控品
中的一种或多种；其中，所述PCR酶系包括DNA聚合酶、UDG酶和逆转录酶；所述PCR反应预混液包括Tris
‑
HCl、KCl、MgCl2、X
‑
100、胆酸钠、dATP、dTTP、dUTP、dCTP和dGTP。9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在用于检测新型冠状病毒以及区分突变株BA.2.X/BA.4.X/BA.5.X时，以待测样品的核酸为模板，采用权利要求4～6任一项所述的用于检测新型冠状病毒以及区...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢晓丹，李烈军，肖新换，谢钰佳，
申请(专利权)人：南京凯普医学检验实验室有限公司广州凯普医药科技有限公司广东凯普生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：