本发明专利技术公开了一种基于琼脂糖凝胶电泳技术快速检测病毒基因组大小的方法，属于病毒检测技术领域。本发明专利技术用于检测基因组大小的试剂盒包括裂解液和上样缓冲液，其原料组分包括：5％十二烷基硫酸钠、0.5M氯化钠、50mM乙二胺四乙酸和6X DNA凝胶上样缓冲染料。采用本发明专利技术提供的检测方法省去了现有方法诸多繁琐的步骤，可以获得更为清晰的凝胶成像结果，极大地缩短了检测时间，尤其适用于快速检测细小病毒科病毒基因组的大小。本发明专利技术具有重要的应用价值，更符合基因治疗药物开发领域病毒检测和质量控制研究工作的需要。控制研究工作的需要。控制研究工作的需要。
【技术实现步骤摘要】
一种快速检测病毒基因组大小的方法及试剂盒
[0001]本专利技术属于病毒检测
，具体涉及一种快速检测病毒基因组大小的试剂盒及其检测方法。
技术介绍
[0002]近年来，病毒类产品已经被广泛地应用于疫苗、基因治疗、癌症治疗等领域。其中，重组腺相关病毒(recombination adeno
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associated virus,rAAV)由于其安全性好、宿主细胞范围广、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被认为是用于人类基因治疗最安全的病毒载体之一，并广泛用于眼部疾病，神经肌肉疾病和中枢神经系统疾病等领域。作为一种新型的治疗方法，为了保证基因药物的药效和稳定性，基因药物(即rAAV)的质量控制极为重要，这包括判别rAAV是否具备生物活性和用量等。目前，rAAV基因药物的生产方法相比20年前有很大提高，但是其质量控制方法的改进则非常有限，这可能与基因治疗在过去的商业化进展缓慢有关。
[0003]腺相关病毒(AAV)是一种复制缺陷的非包膜病毒，属于细小病毒科(Parvoviridae)。众所周知，AAV由直径约为20
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26nm的二十面体蛋白衣壳和一个线性单链DNA基因组组成，基因组大小约为4.7kb，既可以是正链，也可以是负(反义)链，且正链和负链都有相同的概率被包装到AAV病毒颗粒中。
[0004]对rAAV基因药物的质检通常包括滴度检测、衣壳蛋白纯度检测、基因组大小及纯度检测和生物学活性检测等。传统的检测AAV基因组大小主要通过Southern印迹法(Southern Blot)来实现，这一方法步骤复杂、成本高，而且还必须使用放射性同位素，不适合用作基因药物的质量控制方法。此外，由于这些DNA为单链，容易形成各种不同的二级结构，从而导致其在常规琼脂糖凝胶上迁移速率不稳定，无法成为质量控制的有效手段，因此必须使用变性琼脂糖凝胶电泳，使得这些DNA都变成无二级结构的单链后才能判断其分子量大小，从而使得实验方法变得非常繁琐，而且由于必须使用变性胶，对实验条件的要求也增加。目前，仍没有一种简单快速的方法来实现病毒基因组DNA的可视化，特别是很难满足rAAV基因药物质控检测的需求，因此亟需提出有效的解决方案。
技术实现思路
[0005]有鉴于此，本专利技术旨在克服现有技术的不足之处而提供一种快速、高效、简便，在常规实验条件下，即可检测出细小病毒科病毒的基因组大小的快速检测试剂盒及检测方法。
[0006]为实现前述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]一种快速检测病毒基因组大小的方法，在样本中加入裂解液或其稀释液，以将病毒的基因组单链DNA(正链或负链)从其衣壳中释放出来，并且变为比单链DNA更加稳定的双链DNA后进行琼脂糖凝胶电泳检测；所述的病毒选自细小病毒科病毒。
[0008]作为本专利技术的一种优选，所述方法包括向病毒样品中加入裂解液或其稀释液，使
样品中的病毒衣壳裂解，再使用琼脂糖凝胶进行电泳分析；所述的裂解液以水为溶剂，选自以下任意一种：
[0009](1)去污剂；
[0010](2)去污剂和NaCl组成；
[0011](3)由去污剂、NaCl以及螯合剂组成；
[0012](4)由去污剂、NaCl、螯合剂以及其他添加剂组成；
[0013]加入裂解液后，使去污剂在系统中的终浓度为0.01～0.1％，NaCl在系统中的终浓度为0～0.2M，螯合剂在系统中的终浓度为0～6mM。
[0014]作为本专利技术的进一步优选，所述的去污剂选自温和去污剂，优选十二烷基硫酸鈉(SDS)、聚山梨醇酯20(吐温
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20)、TritonX 100、Proteinase K或其混合物；更进一步优选SDS。
[0015]作为本专利技术的进一步优选，所述的螯合剂为EDTA。
[0016]作为本专利技术的更进一步优选，SDS在系统中的终浓度为0.03～0.1％，最优选0.05％。
[0017]作为本专利技术的更进一步优选，NaCl在系统中的终浓度为0.02～0.08M，优选0.05M。
[0018]作为本专利技术的更进一步优选，EDTA在系统中的终浓度为3～6mM，优选5mM。
[0019]在本专利技术的一些优选实施例中，所述裂解液由0.5％SDS、0.5M NaCl和50mM EDTA组成。
[0020]作为本专利技术的一种优选，所述合适的条件为70～100℃加热处理之后在冰上或室温冷却。本专利技术的加热温度为使蛋白裂解的适宜温度。
[0021]作为本专利技术的进一步优选，所述合适的条件为90～100℃加热10～15min之后在室温冷却10～15min；优选95℃加热10min之后在室温冷却10min。
[0022]本专利技术所述的病毒优选腺相关病毒。
[0023]一种病毒裂解液，选自以下任意一种：
[0024](1)0.01％～1％去污剂；
[0025](2)由0.01％～1％去污剂和0.01M～2M NaCl组成；
[0026](3)由0.01％～1％去污剂、0.01M～2M NaCl以及1.5mM～100mM螯合剂组成；
[0027]作为本专利技术的一种优选，所述的去污剂选自温和去污剂，优选十二烷基硫酸鈉(SDS)、聚山梨醇酯20(吐温
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20)、TritonX 100、Proteinase K或其混合物；更进一步优选SDS。
[0028]作为本专利技术的一种优选，所述的螯合剂为EDTA。
[0029]作为本专利技术的进一步优选，SDS浓度为0.3％～1％，最优选0.5％。
[0030]作为本专利技术的进一步优选，NaCl浓度为0.2～0.8M，更进一步优选0.5M。
[0031]作为本专利技术的进一步优选，EDTA浓度为30～60mM，更进一步优选50mM。
[0032]作为本专利技术的最佳优选，所述裂解液由0.5％SDS、0.5M NaCl和50mM EDTA组成。
[0033]一种检测病毒基因组大小的试剂盒，其特征在于包含本专利技术所述的病毒裂解液。
[0034]作为本专利技术的一种优选，所述的裂解液由0.5％SDS、0.5M NaCl和50mM EDTA组成。
[0035]作为本专利技术的一种优选，所述的试剂盒，还包含6X DNA凝胶上样缓冲染料。
[0036]本专利技术的试剂盒可以根据需要追加含有用于各成分的混合的管、微孔板、试纸条
和记载使用方法的指示资料等。检测系统可以为具有荧光读数、化学发光读数、放射读数等功能的仪器。可选的，检测系统还包括电脑和检测分析软件。
[0037]传统的检测AAV基因组大小主要通过Southern blot实现，这一方法步骤复杂，成本高，而且还必须使用用放射性同位素，不适合用作基因药物的质量控制方法。此外，由于这些DNA为单链，容易形成各种不同的二级结构，从而导致其在常规琼脂糖凝胶上迁移速率不稳定，无法成为质量控制的有效手段，必须使用变本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种快速检测病毒基因组大小的方法，其特征在于，在样本中加入裂解液或其稀释液，以将病毒的基因组从其衣壳中释放出来，并且由单链(正链或负链)DNA变为更加稳定的双链DNA后进行琼脂糖凝胶电泳检测；所述的病毒选自细小病毒科病毒。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括向病毒样品中加入裂解液或其稀释液，使样品中的病毒衣壳裂解，再使用琼脂糖凝胶进行电泳分析；所述的裂解液以水为溶剂，选自以下任意一种：(1)去污剂；(2)去污剂和NaCl组成；(3)由去污剂、NaCl以及螯合剂组成；其中，加入裂解液后，使去污剂在系统中的终浓度为0～0.1％，NaCl在系统中的终浓度为0～0.2M，螯合剂在系统中的终浓度为0～6mM。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的去污剂选自温和去污剂，优选十二烷基硫酸鈉(SDS)、吐温～20、TritonX 100、Proteinase K或其混合物；更进一步优选SDS。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的螯合剂为EDTA。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，SDS在系统中的终浓度为0.03％～0.1％，优选0.05％。6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，NaCl在系统中的终浓度为0.02～0.08M，优选0.05M。7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，EDTA在系统中的终浓度为3～6mM，优选5mM。8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其特征在于，所述裂解液由0.5％SDS、0.5M NaCl和50mM EDTA组成。9.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其特征在于，所述合适...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗光佐，孟缘，
申请(专利权)人：南京贝思奥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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