用于电泳提取和富集染色体外DNA的系统、装置和方法制造方法及图纸

本公开的实施方式呈现用于染色体外DNA提取的方法、系统和装置，以及在一些实施方式中的从其中分离DNA，和/或分析提取的和/或分离的DNA，包括在一些实施方式中的ecDNA。包括在一些实施方式中的ecDNA。包括在一些实施方式中的ecDNA。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于电泳提取和富集染色体外DNA的系统、装置和方法
[0001]相关申请
[0002]本申请要求于2020年4月24日提交的美国临时专利申请号63/015,288的优先权权益和优先权，其全部内容通过援引并入本文中。

技术介绍

[0003]在许多原核生物和真核生物中，包括细胞及其细胞器遗传组成的DNA在大小和拓扑结构上可能有显著差异。在哺乳动物中，核染色体DNA是线性的，并且大小范围从几十到几百兆碱基(Mbs)。除了染色体DNA之外，每个哺乳动物细胞通常在其线粒体内携带每个细胞数千个环状16千碱基(kb)DNA的拷贝(Vetri et al.,1990)。
[0004]最近的研究已经示出，真核细胞还包含源自核DNA的染色体外DNA(ecDNA)环。在正常细胞中，这些DNA很小，通常大小小于20kb，并且经常与重复的染色体序列相关(Moller,et al.,2018)。然而，在癌细胞中，也可以发现更大的环状ecDNA，大小范围在10kb大小至几Mb大小，其携带扩增的癌基因或耐药基因(回顾Verhaak,et al.,2019)。
[0005]类似地，在细菌细胞中，经常存在具有平均大小为约4Mb(细菌的染色体大小范围从低百kb至低十几Mb大小)的大环状染色体，并且细菌也携带较小的环状ecDNA，通常称为质粒(Francia et al.,2004；Sherratt,1974)。这些质粒的大小通常从单个kb至低数百kb大小。在致病细菌中，这样的质粒经常携带影响毒力、宿主范围和耐药性的基因(Pilla and Tang,2018；Rozwandowicz et al.,2018)。
[0006]在细菌和哺乳动物细胞两者中，染色体外DNA通常包括占比总细胞DNA的一小部分。目前，染色体外DNA的大多数分子表征是使用全基因组序列数据和从头序列组装算法在生物信息学上执行的。使用高覆盖度的全基因组序列数据，经常可以将ecDNA序列组装成单个环状重叠群。然而，当ecDNA与染色体DNA序列密切相关时，如果它们具有显著水平的重排，则ecDNA的组装可能会很困难(Wu et al.,2019)。
[0007]由于ecDNA在人类疾病中发挥重要作用，因此开发用于分析它们的新的、具有成本效益的方法是非常重要的。

技术实现思路

[0008]本公开的实施方式呈现用于染色体外DNA提取的方法、系统和装置，以及在一些实施方式中的从其中分离DNA，和/或分析提取的和/或分离的DNA。
[0009]因此，在一些实施方式中，提供了一种染色体外DNA(ecDNA)提取和分离方法，该方法包括：提供被配置用于DNA电泳的琼脂糖凝胶柱，所述凝胶柱被配置为包括至少两个分隔室或包含在至少两个分隔室(在整个本公开中，也可以称为腔或孔)中，将包括含有多个细胞的细胞悬浮液的样品沉积在所述至少两个分隔室的第一分隔室内，所述第一分隔室被布置为在第一带正电电极的近侧，所述带正电电极被配置为在电泳期间吸引带负电荷的洗涤剂和DNA，将包括至少一种带负电荷的洗涤剂的裂解试剂沉积在所述至少两个分隔室的第二分隔室内，所述第二分隔室被布置为在第二带负电荷电极的近侧，经由第一和第二电极
施加第一电泳场，使得所述带负电荷的洗涤剂移动至并进入或通过包含所述细胞悬浮液的第一分隔室，使得在所述第一分隔室中的细胞在基本上没有来自液体混合的任何粘性剪切下被裂解，施加第二电泳场或继续所述第一电泳场，以便在适用于期望ecDNA的大小选择的条件下进行电泳，使得所述ecDNA与较大的染色体DNA分子分离并沿所述凝胶柱向下行进，以及从所述凝胶柱中分离出大小选择的ecDNA。
[0010]这样的实施方式可以包括以下特征、功能、结构、步骤、过程、目的、优点和说明中的一个和/或另一个(和在一些实施方式中，多个，和在一些实施方式中，大部分，和在仍其他实施方式中，基本上所有或全部)以产生本公开的又另外的实施方式：
[0011]‑
电泳导致大小大于3Mb的DNA固定在所述琼脂糖凝胶中；
[0012]‑
电泳导致大于3Mb的DNA固定在所述第一分隔室的壁中；
[0013]‑
电泳导致具有小于3Mb大小的DNA沿所述凝胶柱向下行进；
[0014]‑
具有小于3Mb大小的DNA经由电洗脱分离；
[0015]‑
电洗脱导致使大小小于3Mb的DNA的大小级分洗脱至洗脱盒的一个或多个洗脱模块中；
[0016]‑
小于3Mb的DNA包括ecDNA；
[0017]‑
完成电泳的时间段对应于所述ecDNA的大小；
[0018]‑
电泳进行2至9小时。
[0019]‑
分析所述ecDNA；
[0020]‑
分析分离的ecDNA的至少一个特性，其中，所述至少一个特性选自由大小、拓扑结构和序列内容组成的组；
[0021]‑
富集所述ecDNA；
[0022]‑
所述多个细胞包括动物细胞；
[0023]‑
所述多个细胞包括哺乳动物细胞；
[0024]‑
所述多个细胞包括人细胞；
[0025]‑
所述多个细胞包括真菌细胞；
[0026]‑
所述多个细胞包括已经经酶处理以去除细胞壁的真菌细胞；
[0027]‑
所述多个细胞包括植物细胞；
[0028]‑
所述多个细胞包括已经经酶处理以去除细胞壁的植物细胞，否则所述细胞壁会阻止阴离子洗涤剂对细胞的裂解；
[0029]‑
所述多个细胞包括细菌细胞；
[0030]‑
所述多个细胞包括已经经酶处理以去除细胞壁的细菌细胞，否则所述细胞壁会阻止阴离子洗涤剂对细胞的裂解；
[0031]‑
所述细胞悬浮液中的细胞是均匀分散的；
[0032]‑
所述至少两个分隔室被布置为彼此接近；
[0033]‑
从所述凝胶柱中分离所述大小选择的ecDNA是经由电洗脱的；
[0034]‑
施加所述第二电泳场和/或继续所述第一电泳场，以便在适用于期望ecDNA的大小选择的条件下进行电泳，使得所述ecDNA与较大的染色体DNA分子分离开；
[0035]‑
从所述凝胶柱中分离所述大小选择的ecDNA是经由电洗脱的；
[0036]‑
确定所述ecDNA的DNA序列；
[0037]以及
[0038]‑
将所述ecDNA成像，其中，成像可以是经由以下中的至少一种：光学、电子显微术、原子力显微术。
[0039]一种琼脂糖凝胶盒和/或系统，包括至少两个孔/腔/分隔室，用于保持液体样品相对靠近定位，并被配置为能够实现或执行本公开的一种或多种方法。
[0040]参考附图，本公开的这些和其他实施方式、优点和目的将变得甚至更加明显，附图的简要描述在下面提供，并且详细描述在后面。
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种染色体外DNA(ecDNA)提取和分离方法，包括：提供被配置用于DNA电泳的琼脂糖凝胶柱，所述凝胶柱被配置为包括至少两个分隔室或包含在至少两个分隔室中；将包括含有多个细胞的细胞悬浮液的样品沉积在所述至少两个分隔室的第一分隔室内，所述第一分隔室被布置为在第一带正电电极的近侧，所述带正电电极被配置为在电泳期间吸引带负电荷的洗涤剂和DNA；将包括至少一种带负电荷的洗涤剂的裂解试剂沉积在所述至少两个分隔室的第二分隔室内，所述第二分隔室被布置为在第二带负电电极的近侧；经由第一和第二电极施加第一电泳场，使得所述带负电荷的洗涤剂移动至并进入或通过包含所述细胞悬浮液的第一分隔室，使得在所述第一分隔室中的细胞在基本上没有来自液体混合的任何粘性剪切下被裂解；施加第二电泳场或继续所述第一电泳场，以便在适用于期望ecDNA的大小选择的条件下进行电泳，使得所述ecDNA与较大的染色体DNA分子分离并沿所述凝胶柱向下行进；以及从所述凝胶柱中分离出大小选择的ecDNA。2.根据权利要求1所述的方法，其中，电泳导致大于3Mb大小的DNA固定在所述琼脂糖凝胶中。3.根据权利要求2所述的方法，其中，电泳导致大于3Mb的DNA固定在所述第一分隔室的壁中。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，其中，电泳导致具有小于3Mb大小的DNA沿所述凝胶柱向下行进。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，其中，具有小于3Mb大小的DNA经由电洗脱分离。6.根据权利要求5所述的方法，其中，电洗脱导致使大小小于3Mb的DNA的大小级分洗脱至洗脱盒的一个或多个洗脱模块中。7.根据权利要求4
‑
6中任一项所述的方法，其中，小于3Mb的DNA包括ecDNA。8.根据权利要求7所述的方法，其中，完成电泳的时间段对应于所述ecDNA的大小。9.根据权利要求1
‑
7中任一项所述的方法，其中，电泳进行2至9小时。10.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的方法，进一步包括分析所述分离的ecDNA的至少一个特性。11.根据权利要求7或8所述的方法，进一步包括分析分离的ecDNA的至少一个特性。12.根据权利要求1
‑
11中任一项所述的方法，进一步包括富集所述ecDNA。13.根据权利要求1
‑
12中任一项所述的方法，其中，所述多个细胞包括动物细胞、哺乳动物细胞和人细胞中的任一种。14.根据权利要求1

【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：塞奇科学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：