一种不使用氯仿的核酸提取方法技术

本发明专利技术公开了一种不使用氯仿的核酸提取方法，其采用的核酸提取试剂包含以下组分：异硫氰酸胍、Triton X

【技术实现步骤摘要】
一种不使用氯仿的核酸提取方法


[0001]本专利技术涉及核酸提取
，具体涉及一种不使用氯仿的核酸提取方法。

技术介绍

[0002]核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子。核酸提取与纯化是分子生物学最关键的方法之一，是下游核酸检测和分析的前提，所分离的核酸的质量和完整性直接影响下游的研究或诊断结果，高质量核酸的获取是下游过程成功进行的关键。如生物医学研究和临床上进行基因表达水平检测或基因克隆测序等工作之前，都要将核酸从生物样品中提取出来。这里提到的生物样品，包括培养的细胞、动植物组织、体液（如血液、痰液、组织液等）、微生物样品等。众所周知，核酸包括DNA和RNA。DNA是遗传信息的携带者，DNA的突变是导致多种疾病的直接原因；而RNA是将DNA携带的遗传信息转变为有功能的蛋白质的中间桥梁；另外，RNA在生物体内还有多种复杂的调节功能。当需要检测基因型、基因突变或基因表达水平的时候，需要将DNA和/或RNA从生物样品中提取出来。传统的提取或纯化技术只能从生物体中单独提取一种类型的核酸（DNA 或 RNA）或蛋白质。目前主流的核酸提取方法（如TRIzol试剂法）是基于酚/氯仿抽提的原理，可以从有限的细胞或组织材料中同时提取 DNA、RNA和蛋白质，核酸提取试剂（如TRIzol试剂等）的主要成分有酚、胍盐和表面活性剂等。用核酸提取试剂裂解样品后，向裂解产物中加入氯仿并离心，样品会分为下层的有机相，上层的水相和中间相。通常RNA在上层的水相中，DNA在下层的有机相和中间相中，再采用合适的方法就可以提取出高纯度的DNA和RNA用于检测了。该方法将核酸提纯步骤缩短到了一步，有诸多优点，如缩短分离时间，操作简单方便，纯度好、提取效率高，扩大了样品选择范围等。其中，氯仿的加入对蛋白变性和分离DNA与RNA有着重要作用，如果去掉加入氯仿、离心分相的步骤，核酸的回收率和纯度都会大打折扣。但是，氯仿作为危险化学品和易制毒药品，毒性比较大，有麻痹神经和致癌的毒副作用，对人体和环境危害大，而且购买时需要在公安机关备案，保存和使用时都需要严格管理，受到的限制越来越多。目前我国已经有相当一部分机构（如医院的实验室）无法购买氯仿以用于核酸提取。因此，使用安全、低毒的氯仿替代物进行核酸提取有很大的需求。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种不使用氯仿的核酸提取方法。
[0004]为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种不使用氯仿的核酸提取方法，包括以下步骤：1）将10mg的新鲜材料加入到500μL核酸提取试剂中混合，静置至充分裂解；2）加入100μL萃取剂，室温下静置3
‑
5min，离心分层；3）当提取RNA时，将上层的水相吸出，转移至新的离心管中，加入250μL异丙醇混匀，室温静置5min后，离心弃上清液；当提取DNA时，将上层的水相去除干净，颠倒混匀下层溶液，加入250μL异丙醇混匀，室温静置5min后，离心弃上清液；
4）用500μL浓度为75%的乙醇重悬沉淀步骤3）中得到的含RNA/DNA的核酸，涡旋振荡混合均匀，离心弃上清液；5）室温干燥10min，用纯净水溶解步骤4）得到的RNA/DNA，完成核酸的提取；其中，核酸提取试剂包含以下组分：异硫氰酸胍、Triton X
‑
100、苯酚、Tris缓冲液、EDTA和巯基乙醇；所述萃取剂采用了溴氯苯和/或二氯苯。
[0005]作为一种具体的实施方式，所述核酸提取试剂包含以下工作浓度的组分：2
‑
3 mol/L的异硫氰酸胍、0.5
‑
1.5vol%的Triton X
‑
100、40
‑
45vol%的苯酚、45
‑
55mmol/L的Tris缓冲液、10
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15mmol/L的EDTA、0.3
‑
1vol%的巯基乙醇。
[0006]作为一种具体的实施方式，所述溴氯苯选自2
‑
溴氯苯、3
‑
溴氯苯中的至少一种；所述二氯苯选自1,2
‑
二氯苯、1,3
‑
二氯苯中的至少一种。
[0007]作为一种具体的实施方式，细胞RNA的提取包括以下步骤：1）将24孔板培养的细胞去掉培养基后加入到500μL核酸提取试剂中混合，静置至充分裂解；2）混匀后加入100μL溴氯苯和/或二氯苯中的一种或多种的混合液，室温下静置3
‑
5min，而后12000rpm离心5min，分为三层；3）将上层的水相吸出，转移至新的离心管中，加入250μL异丙醇混匀，室温静置5min后12000rpm离心10min，弃上清液；4）用500μL浓度为75%的乙醇重悬沉淀步骤3）中得到的含RNA的核酸，涡旋振荡混合均匀，12000rpm离心5min，弃上清液；5）室温干燥10min，用20μL纯净水溶解步骤4）得到的RNA，完成核酸的提取。
[0008]作为一种具体的实施方式，组织RNA的提取包括以下步骤：1）取10mg新鲜组织，加入500μL核酸提取试剂，充分匀浆，室温静置5min至充分裂解；2）混匀后加入100μL溴氯苯和/或二氯苯中的一种或多种的混合液，手动振荡均匀，室温下静置3
‑
5min，而后12000rpm离心5min，分为三层；3）将上层的水相吸出，转移至新的离心管中，加入250μL异丙醇混匀，室温静置5min后12000rpm离心10min，弃上清液；4）用500μL浓度为75%的乙醇重悬沉淀步骤3）中得到的含RNA的核酸，涡旋振荡混合均匀，12000rpm离心5min，弃上清液；5）室温干燥10min，用100μL纯净水溶解步骤4）得到的RNA，完成核酸的提取。
[0009]由于上述技术方案的运用，本专利技术与现有技术相比具有下列优点：本专利技术的不使用氯仿的核酸提取方法，其采用了溴氯苯、二氯苯来替代氯仿，安全、低毒，不易燃易爆，使用不受管制，并配合本专利技术的核酸提取试剂，能够以高纯度、高产量的提取核酸。
具体实施方式
[0010]下面结合具体实施例来对本专利技术的技术方案作进一步的阐述。
[0011]实施例一本例提供一种细胞RNA的提取方法：1）将24孔板培养的细胞（约20万细胞/孔）去掉培养基后加入到500μL核酸提取试
剂中混合，静置至充分裂解；2）混匀后加入100μL萃取试剂，室温下静置3
‑
5min，而后12000rpm离心5min，分为三层；3）将上层的水相吸出，转移至新的离心管中，加入250μL异丙醇混匀，室温静置5min后12000rpm离心10min，弃上清液；4）用500μL浓度为75%的乙醇重悬沉淀步骤3）中得到的含RNA的核酸，涡旋振荡混合均匀，12000rpm离心5min，弃上清液；5）室温干燥10min，用20μL纯净水溶解步骤4）得到的RNA，完成核酸的提取。
[0012]这里采所采用的核酸提取试剂用于裂解细胞或组织样品本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种不使用氯仿的核酸提取方法，其特征在于，包括以下步骤：1）将10mg的新鲜材料加入到500μL核酸提取试剂中混合，静置至充分裂解；2）加入100μL萃取剂，室温下静置3
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5min，离心分层；3）当提取RNA时，将上层的水相吸出，转移至新的离心管中，加入250μL异丙醇混匀，室温静置5min后，离心弃上清液；当提取DNA时，将上层的水相去除干净，颠倒混匀下层溶液，加入250μL异丙醇混匀，室温静置5min后，离心弃上清液；4）用500μL浓度为75%的乙醇重悬沉淀步骤3）中得到的含RNA/DNA的核酸，涡旋振荡混合均匀，离心弃上清液；5）室温干燥10min，用纯净水溶解步骤4）得到的RNA/DNA，完成核酸的提取；其中，核酸提取试剂包含以下组分：异硫氰酸胍、Triton X
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100、苯酚、Tris缓冲液、EDTA和巯基乙醇；所述萃取剂采用了溴氯苯和/或二氯苯。2.根据权利要求1所述的不使用氯仿的核酸提取方法，其特征在于，所述核酸提取试剂包含以下工作浓度的组分：2
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3 mol/L的异硫氰酸胍、0.5
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1.5vol%的Triton X
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100、40
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45vol%的苯酚、45
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55mmol/L的Tris缓冲液、10
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15mmol/L的EDTA、0.3
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1vol%的巯基乙醇。3.根据权利要求1所述的不使用氯仿的核酸提取方法，其特征在于，所述溴氯苯选自2
‑
溴氯苯、3
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溴氯苯中的至少一种；所述二氯苯选自1,2...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓雷，徐超，陈佳贤，管延斌，闫媛媛，
申请(专利权)人：苏州英泽生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：