【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种双重探针法荧光定量pcr支原体检测试剂盒。
技术介绍
1、目前检测细胞培养或生物制品中支原体污染的方法主要有：a.分离培养法，将待测样品用支原体培养基进行培养看有没有支原体菌落出现，这种方法费时费力，并且很多支原体种类难以进行培养；b.染料定量pcr法，用特异性引物进行定量pcr，这种方法特异性不高，难以分辨细菌带来的假阳性以及样本对pcr抑制造成的假阴性；c.探针定量pcr法，所用引物探针难以覆盖足够种类的支原体。如何解决上述技术问题，是本领域技术人员致力于研究的方向。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种双重探针法荧光定量pcr支原体检测试剂盒。
2、为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种双重探针法荧光定量pcr支原体检测试剂盒，包括内参引物探针和支原体引物探针，
3、所述内参引物探针序列为：
4、myco-ic-f：ggcgtcctgaacagttggactg，
5、myco-ic-r：gttgatgtcttgtgagtggcctc，
6、myco-ic-p：vic-cagcaaagacagcacctacagcatgagc-bhq1；
7、所述支原体引物探针序列为：
8、f1：gaaggcggcttgctgggtc，
9、f2: gaaggcagctaactggaca，
10、f3：gaag
11、f4：gaaggcagctaactgggaa，
12、f5：gaaggcagcttactgggtc，
13、f6：gaaggcggtcgactggcct，
14、r1：gctgcgtcagtgattctccacc，
15、r2：actgcagcactgaccttttggcc，
16、r3；gctgcgtcgatggtttccatc,
17、r4：gctgcagcaccgaacttagtcc，
18、r5：gctgcgccgatgagttccccatc，
19、r6：gctgcgttagtgaaattattccac。
20、作为一种具体的实施方式，所述试剂盒还包含探针法定量pcr预混体系、引物探针预混液、支原体阳性对照、内参对照及超纯水。
21、作为一种具体的实施方式，所述探针法定量pcr预混体系为ez-probe qpcrmaster mix。
22、作为一种具体的实施方式，所述引物探针预混液包括内参引物及探针和支原体引物及探针，所述引物探针预混液的终浓度为10-100um。其中内参引物及探针和支原体引物及探针每一条的浓度均控制在1-10um间。
23、作为一种具体的实施方式，检测过程包括以下步骤：
24、步骤1，将引物探针预混液、探针法定量pcr预混体系、内部质控、阳性质控、超纯水及待测样品放置冰上融化，各组分振荡后离心，其中内部质控包含内参基因dna序列的质粒，且内参基因不与任何支原体序列同源，阳性质控包含了常见支原体dna序列的质粒；
25、步骤2，取探针法定量pcr预混体系15μl、引物探针预混液3μl、内部质控2μl，充分震荡混匀，低速离心，将管盖残留液体收集至管底形成支原体检测预混液，向每孔反应管中分装20μl 支原体检测预混液，而后向已分装过支原体检测预混液的反应管中加入样品或阳性质控，每种两孔重复，
26、其中，阴性对照nc由20μl支原体检测预混液与10μl 超纯水混合而成；阳性对照pc由20μl 支原体检测预混液与10μl 阳性质控混合而成；待测样品s由20μl支原体检测预混液与10μl待测样品混合而成；
27、步骤3，启动qpcr仪探针法程序，进行检测，判定结果。
28、由于上述技术方案的运用，本专利技术与现有技术相比具有下列优点：本专利技术提供了一种双重探针法荧光定量pcr支原体检测试剂盒，其通过比对支原体序列设计引物探针组合，以避免现有技术中的假阴性、假阳性以及支原体种类覆盖不足等问题，可检测《中国药典》、《欧洲药典》要求的全部10种支原体，并且可以检测超过90种支原体，特异性强，不受大肠杆菌、人基因组等干扰；灵敏度高，可检测低至10cfu/ml。
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1.一种双重探针法荧光定量PCR支原体检测试剂盒，其特征在于，包括内参引物探针和支原体引物探针，
2.根据权利要求1所述的一种双重探针法荧光定量PCR支原体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含探针法定量PCR预混体系、引物探针预混液、支原体阳性对照、内参对照及超纯水。
3.根据权利要求2所述的一种双重探针法荧光定量PCR支原体检测试剂盒，其特征在于，所述探针法定量PCR预混体系为EZ-Probe qPCR Master Mix。
4.根据权利要求2所述的一种双重探针法荧光定量PCR支原体检测试剂盒，其特征在于，所述引物探针预混液包括内参引物及探针和支原体引物及探针，所述引物探针预混液的终浓度为10-100uM。
5.根据权利要求4所述的一种双重探针法荧光定量PCR支原体检测试剂盒，其特征在于，检测过程包括以下步骤：
【技术特征摘要】
1.一种双重探针法荧光定量pcr支原体检测试剂盒，其特征在于，包括内参引物探针和支原体引物探针，
2.根据权利要求1所述的一种双重探针法荧光定量pcr支原体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含探针法定量pcr预混体系、引物探针预混液、支原体阳性对照、内参对照及超纯水。
3.根据权利要求2所述的一种双重探针法荧光定量pcr支原体检测试剂盒，其特征在于，所述探针...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐国凯，袁新旺，刘晓雷，
申请(专利权)人：苏州英泽生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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