使用DNA结合阻遏物在原核细胞中的转录控制制造技术

本公开内容总体上涉及用于将基因线路从一种原核细胞(“供体细胞”)转移到另一种原核细胞(“受体细胞”或“靶细胞”，其在本文中可互换使用)的方法和组合物。更具体而言，本公开内容涉及包含(i)目的基因线路和(ii)一种或多种表达的转录阻遏蛋白的原核供体细胞，以及所述供体细胞将基因线路有效转移到原核受体细胞内的用途。基因线路包括编码目的RNA分子或蛋白质的核酸序列。白质的核酸序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用DNA结合阻遏物在原核细胞中的转录控制


[0001]本公开内容总体上涉及用于将基因线路(genetic circuit)从一种原核细胞(“供体细胞”)转移到另一种原核细胞(“受体细胞”或“靶细胞”，其在本文中可互换使用)的方法和组合物。

技术介绍

[0002]控制来自给定启动子的转录的诱导型系统是分子生物学中的有用工具[1]–
[3]。一般而言，这些系统由蛋白质阻遏物组成，所述蛋白质阻遏物与其同源DNA操纵基因的结合取决于诱导物的存在。在诱导物的不存在下，阻遏物能够识别其操纵基因，阻止来自启动子的转录；当诱导物存在时，或通过诱导物与阻遏物的结构域结合或通过改变其3D构象，阻遏物不再能够识别其操纵基因，从而激活转录。诱导物可以是化学的(IPTG、糖、小分子、蛋白质等)或物理的(热、光、压力、pH等)。存在阻止转录或降低细胞中制备的蛋白质量的许多其它方法：蛋白质的条件降解、生产菌株中的质粒拷贝数减少等。这些方法并不阻遏启动子本身，而是作用于基因线路的其它组分[22]。
[0003]在一些情况下，可能期望控制宿主中的特异性基因的转录/翻译，同时能够在诱导物的不存在下在靶细菌中激活它。例如，在对靶细菌毒性的蛋白质和/或核酸(例如含有CRISPR
‑
Cas9的线路)的噬菌粒转导的情况下[14]，待用于生产颗粒的菌株不表达由线路编码的毒性蛋白和/或核酸是必须的：否则，生产菌株将被杀死或严重受损。然而，毒性蛋白和/或核酸在靶菌株中表达/转录，以诱导细胞死亡如序列特异性细胞死亡或靶菌株中任何其它类型的所需功能是必要的。对于将注入靶菌株中的任何其它毒性组分也是如此，这也可能致使其对于生产菌株毒性。另外，已显示了尤其是当它们施加负担(例如毒性组分，或在生产菌株中具有不需要的功能的任何组分)时，基因线路中组分的组成型表达对于细胞是不利的，并且它们趋于被缺失或突变，导致不希望有的设计和组分破坏[15]。在这个意义上，从改造/制造的观点来看，具有仅在生产菌株中起作用的条件阻遏物是有利的。
[0004]已提供了对于基因线路转导的具体情况所提议的解决方案，并且其涉及正调节物(噬菌体聚合酶及其同源启动子)。靶细胞可能仅含有启动子或聚合酶，而其它组分由噬菌粒转导[12][13]。然而，这在以下情况下不是实用的方法：当与野生型菌株工作时，因为难以转化组分之一，或者在其中不可能用线路组分之一预装载靶细胞的环境(例如，肠道环境)中。
[0005]关于这点的另一个可能的解决方案将是表达反式控制毒性组分的表达(即，并不在待包装的线路中编码)的阻遏物。在这种情况下，阻遏物将仅存在于生产菌株中，而不存在于靶菌株中。然而，存在与这种方法相关的主要问题：由于用于生产噬菌粒的菌株与需要靶向的菌株是同一物种(或至少非常密切相关)，因此需要仔细选择所使用的阻遏物。例如，使用AraC或LacI将有效地阻遏生产菌株中毒性组分的反式转录，并且以这种方式生产的噬菌粒将“裸露的”组成型启动子注入靶菌株内。然而，如果这些是野生型菌株，则它们很可能含有其自身的LacI或AraC基因，因此注入的启动子将立即被阻遏。甚至抗生素诱导的系统
如TetR，在许多野生型菌株中也是非常常见的。当使用噬菌体主
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阻遏物
‑
启动子对时，可以发生同样的情况：野生型菌株在其基因组中携带许多原噬菌体，并且其中许多可以编码识别所使用的启动子的阻遏物。

技术实现思路

[0006]本文描述的是用于将目的基因线路从一种原核细胞(在本文中称为“供体细胞”)转移到另一种原核细胞(在本文中称为“受体细胞”或“靶细胞”)的新方法和组合物。在某些方面，原核细胞是细菌细胞。进一步地，基因线路包含在阻遏物结合序列(在本文中也称为启动子/操纵基因)的转录控制下的目的核酸。所述目的核酸序列可以编码目的蛋白质或RNA。
[0007]所公开的方法和组合物基于一种或多种阻遏蛋白在供体细胞中的表达，以及位于基因线路内的阻遏物结合序列的存在，当存在于供体细胞中时，它们起阻遏目的核酸序列的转录的作用。基因线路并不编码所述一种或多种阻遏蛋白。因此，在基因线路转移到受体细胞内之后，然后目的核酸序列被转录，所述受体细胞因其缺乏所述一种或多种阻遏蛋白的表达而被选择。
[0008]提供了用于将基因线路从供体细胞转移到受体细胞或靶细胞的方法。所述转移可以通过各种不同的方法来实现。转移的非限制性实例例如包括细菌转导、接合和转化。在一个具体方面，细菌递送媒介物例如细菌噬菌体支架在供体细胞中组装，作为用于将基因线路有效转移到受体细胞或靶细胞内的手段。在此类情况下，供体细胞包含原噬菌体序列，其反式提供了用于将基因线路组装到细菌噬菌体颗粒内所需的细菌噬菌体组分，例如衣壳蛋白。进一步地，将基因线路改造为含有顺式作用包装信号，其介导基因线路衣壳化到衣壳内。
[0009]因此，本专利技术涉及将基因线路从供体细胞转移到靶细胞的方法，其包括使供体细胞与靶细胞接触足够量的时间，以允许基因线路转移到靶细胞内，其中所述供体细胞表达阻遏蛋白，所述阻遏蛋白并不由基因线路编码并且不存在于靶细胞中，并且其中所述基因线路包含在阻遏物结合序列的转录控制下的目的核酸序列。供体细胞可以是细菌供体细胞，并且靶细胞可以是细菌靶细胞。基因线路可以在转移前在细菌递送媒介物内进行包装。优选地，在递送媒介物中包装的基因线路是包装的噬菌粒。目的核酸序列可以编码目的蛋白质和/或目的RNA分子。特别地，目的核酸序列可以编码这样的蛋白质：(i)其为毒性蛋白，优选对细菌细胞特别是靶细胞毒性的蛋白质，更特别是选自以下的毒性蛋白：穿孔素(holin)、内溶素、限制性酶和影响靶细胞存活或生长的毒素，(ii)其为核酸酶，优选CRISPR核酸酶，和/或其为治疗性蛋白质。可替代地或另外，目的核酸序列可以编码特别是选自mRNA、crRNA、tRNA、iRNA、asRNA、核酶RNA、引导RNA和RNA适体的目的RNA分子。在一个特定实施方案中，目的核酸序列编码CRISPR核酸酶，并且基因线路进一步包含编码引导RNA的核酸序列，优选地，编码引导RNA的所述核酸序列处于组成型启动子的转录控制下。在一些实施方案中，目的核酸序列是编码RNA例如mRNA、crRNA、tRNA、iRNA (干扰RNA)、asRNA (反义RNA)、核酶RNA、RNA适体或引导RNA的核酸，CRISPR基因座，毒素基因，编码酶例如核酸酶或激酶的基因，编码选自Cas核酸酶、Cas9核酸酶、TALEN、ZFN和大范围核酸酶的核酸酶的基因，编码重组酶、细菌受体、膜蛋白、结构蛋白或分泌蛋白的基因，编码对抗生素或一般而言
的药物的抗性的基因，编码毒性蛋白或毒性因子的基因，以及编码毒力蛋白或毒力因子的基因，或其任何组合。更特别地，目的核酸序列可以选自编码下述中的一种或多种的核酸：Cas核酸酶、Cas9核酸酶、引导RNA、CRISPR基因座、毒素、酶、核酸酶、激酶、TALEN、ZFN、大范围核酸酶、重组酶、细菌受体、膜蛋白、结构蛋白、分泌蛋白、赋予对抗生素或药物的抗性的蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种将基因线路从供体细胞转移到靶细胞的方法，其包括使供体细胞与靶细胞接触足够量的时间，以允许所述基因线路转移到靶细胞内，其中所述供体细胞表达阻遏蛋白，所述阻遏蛋白并不由所述基因线路编码并且不存在于靶细胞中，并且其中所述基因线路包含在阻遏物结合序列的转录控制下的目的核酸序列。2.权利要求1的方法，其中所述供体细胞是细菌供体细胞，并且所述靶细胞是细菌靶细胞。3.权利要求1或2的方法，其中所述基因线路在转移前在细菌递送媒介物内进行包装。4.权利要求3的方法，其中在递送媒介物中包装的所述基因线路是包装的噬菌粒。5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述目的核酸序列编码目的蛋白质和/或目的RNA分子。6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述目的核酸序列编码目的蛋白质。7.权利要求6的方法，其中所述目的蛋白质是毒性蛋白。8.权利要求7的方法，其中所述毒性蛋白对细菌细胞，优选对所述靶细胞是毒性的。9.权利要求6至8任一项的方法，其中所述蛋白质是核酸酶，优选CRISPR核酸酶。10.权利要求7或8的方法，其中所述毒性蛋白选自穿孔素、内溶素、限制性酶或影响靶细胞存活或生长的毒素。11.权利要求6至10中任一项的方法，其中所述目的蛋白质是治疗性蛋白质。12.权利要求1至11中任一项的方法，其中所述目的核酸序列编码目的RNA分子。13.权利要求12的方法，其中所述目的RNA分子选自mRNA、crRNA、tRNA、iRNA、asRNA、核酶RNA、引导RNA和RNA适体。14.权利要求12的方法，其中所述目的RNA分子是asRNA。15.权利要求12的方法，其中所述目的RNA分子是引导RNA。16.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述目的核酸序列编码CRISPR核酸酶，并且所述基因线路进一步包含编码引导RNA的核酸序列。17.权利要求16的方法，其中编码引导RNA的所述核酸序列处于组成型启动子的转录控制下。18.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述目的核酸序列是编码RNA例如mRNA、crRNA、tRNA、iRNA (干扰RNA)、asRNA (反义RNA)、核酶RNA、RNA适体或引导RNA的核酸，CRISPR基因座，毒素基因，编码酶例如核酸酶或激酶的基因，编码选自Cas核酸酶、Cas9核酸酶、TALEN、ZFN和大范围核酸酶的核酸酶的基因，编码重组酶、细菌受体、膜蛋白、结构蛋白或分泌蛋白的基因，编码对抗生素或一般而言的药物的抗性的基因，编码毒性蛋白或毒性因子的基因，以及编码毒力蛋白或毒力因子的基因，或其任何组合。19.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述目的核酸序列选自编码下述中的一种或多种的核酸：Cas核酸酶、Cas9核酸酶、引导RNA、CRISPR基因座、毒素、酶、核酸酶、激酶、TALEN、ZFN、大范围核酸酶、重组酶、细菌受体、膜蛋白、结构蛋白、分泌蛋白、赋予对抗生素或药物的抗性的蛋白质、毒性蛋白或毒性因子、毒力蛋白和毒力因子。20.权利要求1至19中任一项的方法，其中所述阻遏蛋白选自表1中列出的阻遏蛋白，优选地选自PhlF、SrpR、LitR、PsrA、AmeR、McbR、QacR、TarA、ButR、Orf2和ScbR。21.一种包含基因线路的供体细胞，所述基因线路包含受阻遏蛋白控制的转录启动子，
所述阻遏蛋白由所述供体细胞表达，但并不由所述基因线路编码。22.权利要求21的供体细胞，其中所述基因线路包含置于所...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：艾力格生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：