抵抗蛋白水解降解的嵌合受体结合蛋白制造技术

本公开提供抵抗蛋白水解消化的嵌合受体结合蛋白(RBP)，其中所述RBP包含衍生自细菌噬菌体的受体结合蛋白的一部分，其通过由1

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抵抗蛋白水解降解的嵌合受体结合蛋白


[0001]本公开涉及嵌合受体结合蛋白，其特别是衍生自细菌噬菌体受体结合蛋白，能够耐受蛋白水解消化，特别是胃肠蛋白水解消化的嵌合受体结合蛋白；包含所述嵌合受体结合蛋白的细菌递送媒介物；以及其在将期望的有效载荷有效转移到目标细菌细胞群的用途，特别是在口服给予之后。
[0002]背景
[0003]在考虑基于蛋白的DNA递送载体比如包装的噬菌粒或时，待解决的关键方面之一为其在体内条件下的稳定性。取决于给予途径，包装的噬菌粒可能被暴露于可能影响其稳定性和功能性的不同因素。例如，口服给予的包装的噬菌粒将必须穿过胃肠道：恶劣的条件，比如胃中低pH和某些消化酶的存在，可能会对颗粒的结构稳定性具有负面影响。
[0004]噬菌体已经演化为在广泛范围的条件下均为稳定的[1]。从演化的观点来看，能够抵抗这些条件对于任何噬菌体均为明显的优势。
[0005]然而，众所周知许多噬菌体在很长一段时间内不能抵抗低pH值[1],[2]，尽管这可通过使用胃酸中和剂来避免[3]‑
[6]。类似地，一些噬菌体已经演化为抵抗消化酶，比如在胰液中发现的那些(胰蛋白酶、糜蛋白酶等)，而另一些噬菌体则易于被降解[4],[7],[8]，尽管降解的确切机制尚未进行详细研究。
[0006]从这些事实可以得出结论，为开发高度成功的最佳噬菌体衍生的DNA递送载体比如获得在体内条件下稳定的载体是有用的。
[0007]本公开提供对这一需求的解决方案。
[0008]如WO2020109339中所公开的，已经开发了强大的工程管线来产生具有改进或改变的宿主范围的噬菌体衍生的DNA递送载体。为做此事，已经利用噬菌体部分的自然变异性在现有的噬菌体支架中产生功能性蛋白嵌合体：例如，能够通过改变λ形噬菌体比如λ噬菌体的两个主要宿主范围决定簇，gpJ和STF(侧尾丝)蛋白，来改变包装的噬菌粒的向性和注射效率。
[0009]在载体开发的过程中，观察到必须在功能性和稳定性之间进行区分。给定的蛋白嵌合体(例如STF融合)可表现出理想的功能性，例如可助于在体外条件下进入目标菌株中的高注射效率，但当暴露于胰酶时可能会受到影响(即仍为功能性的但不太稳定)。到目前为止，这是蛋白质设计改造过程的不可预测的方面：从在胰酶的存在下不会降解的两种不同STF开始可能产生不太抵抗蛋白水解消化的蛋白嵌合体。
[0010]可以设想不同的直接(在包装的噬菌粒本身上)或间接(在包装的噬菌粒的环境上)的方法来保护这些蛋白嵌合体免受体内蛋白水解消化，例如合适的制剂，比如使得可在肠或结肠中释放显示所述蛋白嵌合体的包装的噬菌粒的控制或延迟释放制剂。本公开表明，另一种解决方案为直接作用于所述蛋白嵌合体。
[0011]概述
[0012]本公开基于意想不到地发现，即通过专门设计在两个不同的STF之间的小的融合
区(也称为接头区)，可使得最初被设计改造为完全功能性的但在胰酶的存在下不太稳定的嵌合的基于λ的STF蛋白为既功能性又高度稳定。
[0013]值得注意的是，在天然噬菌体STF中，由于构象或与其他残基/蛋白的相互作用而存在的可蛋白水解降解的残基在正常条件下可能无法降解。然而，当这些STF被用于生产嵌合体时，此类残基可变为可降解。已经特别地证明，在对应于邻近于嵌合λSTF
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V10的插入位点的约10
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12个氨基酸区域的接头区中存在的苯丙氨酸(F)和赖氨酸(K)残基中引入点突变，使得嵌合λSTF
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V10蛋白部分地抵抗胰酶，因此具有增加的稳定性，而初始嵌合λSTF
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V10蛋白根本不抵抗胰酶。
[0014]还已经证明，将接头区设计为包括最初存在于被用于产生嵌合体的V10尾丝的C
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末端区的N
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末端的短序列，使得嵌合λSTF
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V10蛋白高度抵抗胰酶(而不在接头区中引入进一步的突变)。
[0015]进一步地已经证明，在另一种嵌合受体结合蛋白，即在胰酶的存在下不是很稳定的功能性嵌合λSTF
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K5蛋白中，在接头区引入最初存在于V10尾丝N
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末端处的相同的螺旋形成序列，使得嵌合STF
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K5蛋白高度抵抗胰酶，因此强烈稳定。
[0016]此外，已经证明，在于胰酶的存在下不是很稳定的另一种功能性嵌合λSTF
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K5蛋白中，在接头区引入存在于埃希氏菌噬菌体ZG49的STF蛋白内的另一种螺旋形成序列(其与野生型K5蛋白具有同源性)，使得嵌合STF
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K5蛋白非常高度抵抗胰酶。
[0017]因此，本公开涉及抵抗蛋白水解消化(特别是在胃肠道内)的嵌合受体结合蛋白(RBP)，其中所述嵌合RBP包含衍生自细菌噬菌体的受体结合蛋白的一部分，其通过由1到至多70个氨基酸(更特别地1到至多30个氨基酸)组成的设计的接头区与衍生自不同细菌噬菌体的受体结合蛋白的一部分融合，其中所述接头区被设计为抵抗蛋白水解消化，特别是在胃肠道内。在特定实施方案中，所述嵌合RBP抵抗通过胰酶的蛋白水解消化，并且所述接头区被设计为抵抗通过胰酶的蛋白水解消化。
[0018]在特定实施方案中，所述RBP为侧尾丝(STF)蛋白、L形丝、长尾丝或尾刺尖。在特定实施方案中，所述嵌合RBP包含衍生自λ形细菌噬菌体的STF蛋白一部分，其通过由1到至多70个氨基酸(更特别地1到至多30个氨基酸)组成的设计的接头区与衍生自不同细菌噬菌体的RBP蛋白的一部分融合。在特定实施方案中，所述嵌合RBP包含衍生自λ形细菌噬菌体的STF蛋白的N
‑
末端区，其通过由1到至多70个氨基酸(更特别地1到至多30个氨基酸)组成的设计的接头区与衍生自不同细菌噬菌体的RBP蛋白的C
‑
末端区融合，其中所述N
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末端区和C
‑
末端区在与选自氨基酸SAGDAS(SEQ ID NO:1)、ADAKKS(SEQ ID NO:2)、MDETNR(SEQ ID NO:3)、SASAAA(SEQ ID NO:4)和GAGENS(SEQ ID NO:5)的位点具有至少80％同一性的被称为插入位点的N
‑
末端STF区的位点内融合。在特定实施方案中，所述插入位点与序列GAGENS(SEQ ID NO:5)具有至少80％同一性。在特定实施方案中，所述设计的接头区处于插入位点的C
‑
末端处。在特定实施方案中，所述设计的接头区为嵌合RBP的N
‑
末端区或C
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末端区的一部分。
[0019]在特定实施方案中，对应于可能被胰蛋白酶和/或糜蛋白酶靶向的野生型结构域序列的氨基酸的设计的接头区的至少一个氨基酸与野生型结构域序列相比较为突变的。在所述特定实施方案中，所述设计的接头区可为嵌合RBP的C
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末端区的一部分并且所述至少一个氨基酸可位于插本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.抵抗蛋白水解消化的嵌合受体结合蛋白(RBP)，其中所述RBP包含衍生自细菌噬菌体的受体结合蛋白的一部分，其通过由1
‑
70个氨基酸组成的设计的接头区与衍生自不同细菌噬菌体的受体结合蛋白的一部分融合，其中所述接头区被设计为抵抗蛋白水解消化。2.根据权利要求1的嵌合RBP，其中所述设计的接头区由1
‑
30个氨基酸组成。3.根据权利要求1或2的嵌合RBP，其中所述嵌合RBP抵抗胰酶的蛋白水解消化，并且所述接头区被设计为抵抗胰酶的蛋白水解消化。4.根据权利要求1
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3中任何一项的嵌合RBP，其中所述RBP为侧尾丝(STF)蛋白、L形丝、长尾丝或尾刺尖。5.根据权利要求4的嵌合RBP，其中所述嵌合RBP包含衍生自λ形细菌噬菌体的STF蛋白一部分，其通过由1
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70个氨基酸或1
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30个氨基酸组成的设计的接头区与衍生自不同细菌噬菌体的RBP蛋白的一部分融合。6.根据权利要求4或5的嵌合RBP，其中所述嵌合RBP包含衍生自λ形细菌噬菌体的STF蛋白的N
‑
末端区，其通过由1
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70个氨基酸或1
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30个氨基酸组成的设计的接头区与衍生自不同细菌噬菌体的RBP蛋白的C
‑
末端区融合，其中所述N
‑
末端区和C
‑
末端区在与选自氨基酸SAGDAS(SEQ ID NO:1)、ADAKKS(SEQ ID NO:2)、MDETNR(SEQ ID NO:3)、SASAAA(SEQ ID NO:4)和GAGENS(SEQ ID NO:5)的位点具有至少80％同一性的被称为插入位点的N
‑
末端STF区的位点内融合。7.根据权利要求6的嵌合RBP，其中所述插入位点与序列GAGENS(SEQ ID NO:5)具有至少80％同一性。8.根据权利要求6或7的嵌合RBP，其中所述设计的接头区处于所述插入位点的C
‑
末端处。9.根据权利要求6
‑
8中任何一项的嵌合RBP，其中所述设计的接头区为所述嵌合RBP的N
‑
末端区或C
‑
末端区的一部分。10.根据权利要求9的嵌合RBP，其中所述对应于可能被胰蛋白酶和/或糜蛋白酶靶向的野生型结构域序列的氨基酸的设计的接头区的至少一个氨基酸与所述野生型结构域序列相比较为突变的。11.根据权利要求10的嵌合RBP，其中所述设计的接头区为所述嵌合RBP的C
‑
末端区的一部分并且所述至少一个氨基酸位于所述插入位点后的15个氨基酸内。12.根据权利要求10或11的嵌合RBP，其中所述氨基酸选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、亮氨酸(L)和甲硫氨酸(M)。13.根据权利要求9的嵌合RBP，其中所述N
‑
末端区或所述C
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末端区包含所述接头区的序列，所述序列与其所衍生自的RBP的N
‑
末端区或C
‑
末端区中的相应序列相同，并且与区别仅为不存在所述接头区的嵌合RBP相比较，所述序列恢复所述嵌合RBP对蛋白水解消化的抗性。14.根据权利要求6
‑
8中任何一项的嵌合RBP，其中所述设计改造的接头区包含并非衍生自所述嵌合RBP的N
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末端区和C
‑
末端区所衍生自的RBP之一的异源性氨基酸序列或者由其组成。15.根据权利要求13或14的嵌合RBP，其中所述设计的接头区包含螺旋或螺旋束。16.根据权利要求13
‑
15中任何一项的嵌合RBP，其中所述设计的接头区可由10到至多
20个氨基酸组成。17.根据权利要求13
‑
16中任何一项的嵌合RBP，其中所述设计的接头区包含氨基酸序列GSATDVMIQL(SEQ ID NO:6)或GSATDVMIQLA(SEQ ID NO:7)或者由其组成。18.根据权利要求13
‑
15中任何一项的嵌合RBP，其中所述设计的接头区由50
‑
65个氨基酸组成。19.根据权利要求18的嵌合RBP，其中所述设计的接头区包含SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36或者由其组成。20.根据权利要求17或19的嵌合RBP，其中所述序列直接位于所述插入位点之后。21.根据权利要求6
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20中任何一项的嵌合RBP，其中衍生自所述λ形细菌噬菌体的所述STF蛋白的N
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末端区对应于序列SEQ ID NO:8的λSTF蛋白的氨基酸1
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528。22.根据权利要求6
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21中任何一项的嵌合RBP，其中衍生自所述不同细菌噬菌体的所述STF蛋白的C
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末端区对应于序列SEQ ID NO:16的STF蛋白的氨基酸208
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875或对应于序列SEQ ID NO:16的STF蛋白的氨基酸218
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875。23.根据权利要求22的嵌合RBP，其中所述嵌合RBP包含序列SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11或者由其组成。24.根据权利要求6
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21中任何一项的嵌合RBP，其中衍生自所述不同细菌噬菌体的所述STF蛋白的C
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末端区对应于序列SEQ ID NO:12的STF...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：艾力格生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：