用于提取细菌中质粒DNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于提取细菌中质粒DNA的方法，属于生物制药技术领域。本发明专利技术在两个串联的混合组件中实现质粒生产过程中的裂解和中和，具体包括以下步骤：(1)混合，(2)裂解，(3)中和；其中，步骤(1)在第一混合组件中完成，步骤(2)在裂解螺旋管中完成，步骤(3)在第二混合组件中完成，第一混合组件、裂解螺旋管和第二混合组件依次串联。本发明专利技术的质粒制备工艺中的设备简单，操作方便，成本低廉，不需要专业的定制化和价格高昂的设备，可去除细胞裂解过程中的大量杂质，成分安全，实现自动化连续裂解，利于工业化生产。利于工业化生产。利于工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
用于提取细菌中质粒DNA的方法


[0001]本专利技术属于生物制药
，具体涉及一种用于提取细菌中质粒DNA的方法。

技术介绍

[0002]近年来，由于基因治疗和DNA疫苗临床上的成功，人们对工业化规模的质粒发酵生产需求已经非常迫切。基因治疗是将外源基因导入靶细胞，在患者细胞中表达基因来治疗或预防疾病，其最终目标是通过添加、纠正或替换基因来治愈遗传和后天疾病。实现这些目标的基因治疗载体主要有两种，即以灭活病毒为基础的病毒载体和以质粒DNA为基础的非病毒载体。DNA疫苗又称核酸疫苗或基因疫苗，是指将编码某种蛋白质抗原的重组真核表达载体直接注射到体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，从而诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答。DNA疫苗被称为继灭活疫苗、弱毒疫苗和亚单位疫苗之后的“第三代疫苗”，具有广阔的发展前景，而质粒为DNA疫苗的常用载体。所以质粒的大规模生产技术对于基因治疗和DNA疫苗的发展至关重要。
[0003]当前规模化质粒的生产技术主要包括以下几道工序：载体构建、细菌发酵、菌体裂解、固液分离及澄清、质粒纯化。虽然目前的质粒生产工艺可以生产出符合药学质量标准的质粒，满足临床要求，但在这些工艺中还存在一些难以克服的瓶颈。如产量规模化(千克级)较难，载体拷贝数、稳定性问题，裂解过程中导致DNA变性、HCD残留去除，固液分离较难，内毒素残留等难题。
[0004]用于生物制药的质粒DNA主要在大肠杆菌中生产，碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，利用碱性条件将细胞裂解，同时染色体DNA发生不可逆变性，而质粒DNA在pH恢复中性时可复性的原理，将质粒与染色体DNA分离。质粒制备的第一步也是最关键的一步是细胞裂解，如何将细胞彻底裂解，染色体DNA完全共沉淀，去除大部分的RNA成为细胞裂解的核心问题。目前工业规模的质粒提取工艺存在的主要问题有：1、碱裂解无自动化设备或设备能力满足不了充分混合的要求；2、使用大量有机溶剂及酸液，这在大规模工业化生产中增加安全风险及对厂房设备要求较高；3、使用中和液(溶液Ⅲ)混合后，无自动化的混合设备或混合设备满足不了均匀低剪切的混合要求；4、中和混合液固液分离生产成本较高；5、宿主DNA残留较高；6、RNA去除率较低，影响下游纯化；7、重复用管路设备清洗困难，不利于CIP清洗，而一次性耗材设备成本较高。
[0005]中国专利CN111808716A公开了一种质粒提取装置，包括裂解容器、沉淀容器、洗脱液容器、收集容器和层析柱，所述裂解容器与沉淀容器之间通过第一连接管连通，所述沉淀容器与层析柱之间通过第二连接管连通，所述洗脱液容器与层析柱之间通过第三连接管连通，所述第一连接管、第二连接管和第三连接管上均设置有阀门，所述收集容器设置在层析柱的下方，所述层析柱连接有振动机构。上述技术方案采取了振动式结构，加工过程不连续，需要进一步提升加工效率，并且该种方式存在宿主DNA残留较高的问题，还需要进一步改进。
[0006]虽然我们为了解决目前大规模生产质粒DNA的方法存在的缺陷，先前研发了一种
通过混合腔震荡的方式进行裂解、中和提取细菌中质粒DNA的方法(参见：200610114061.6，一种连续大量提取质粒的方法)，但是其不容易放大，提取的质粒DNA的效率较低；为解决这一问题，我们又研发了通过气泡混合器提取质粒DNA的装置(参见：202011120617.9，用于提取细菌中质粒DNA的气泡发生装置)，其使菌液与裂解液能均一且充分混合，气泡混合有效降低剪切力，有效提高收率与质量，但是其仍存在不太容易放大的问题，需要根据规模定制不同大小的气泡混合器，摸索通气量，流速等放大条件。
[0007]因此，我们又专利技术设计了一种新的质粒DNA的提取方法，除了能有效控制混合过程剪切力，更容易实现放大工艺，相比通过气泡混合器(气泡发生装置)的方式，能有效提高裂解及中和过程的混合效率，增加收率；通过易控地调节混合参数，能有效控制剪切力，提高质粒质量。并且此工艺所用的装置原理简单，可精准调控，因此缩短放大条件摸索的时间，进一步提高工作效率，会大大促进连续地、大规模提取质粒DNA相关研究的发展，具有重要意义。

技术实现思路

[0008]本专利技术针对现有技术中存在的问题，提供一种用于提取细菌中质粒DNA的方法，其所需设备简单，操作方便，且成本低廉，不需要专业的定制化、价格高昂的设备，就可以去除细胞裂解过程中的大量杂质，成分安全，可以实现自动化连续裂解，有利于工业化生产。
[0009]为实现上述专利技术目的，本申请的技术方案如下：
[0010]一方面本专利技术提供一种用于提取细菌中质粒DNA的方法，在两个串联的混合组件中实现质粒生产过程中的裂解和中和，具体包括以下步骤：
[0011](1)混合；
[0012](2)裂解；
[0013](3)中和；
[0014]其中，步骤(1)在第一混合组件中完成，步骤(2)在裂解螺旋管中完成，步骤(3)在第二混合组件中完成，第一混合组件、裂解螺旋管和第二混合组件依次串联。优选地，所述第一混合组件的转速为50rpm
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1500rpm，优选为200rpm
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500rpm；所述第二混合组件的转速为20rpm
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1000rpm，优选为150rpm
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500rpm。
[0015]优选地，在步骤(2)中，裂解2min
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10min，优选5min。
[0016]优选地，所述第一混合组件和第二混合组件的结构各自独立地选自搅拌式、乳化式、离心式中的任一种，所述第一混合组件和第二混合组件均优选为混合泵或搅拌器；优选地，所述第一混合组件为搅拌式或乳化式，所述第二混合组件为离心式。
[0017]优选地，所述第一混合组件和第二混合组件分别为第一混合泵和第二混合泵，所述第一混合泵和第二混合泵的泵腔体积与单个混合泵额定每分钟进料体积的比值范围均为1：6
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1:1，优选为1:6
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1:3；或所述第一混合泵和第二混合泵的泵腔体积均为料液流经泵腔内10s
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60s的体积，优选为料液流经泵腔内10s
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20s的体积。所述第一混合泵和第二混合泵的叶轮均优选为半闭式叶轮。通过采用混合泵的形式，使得裂解和中和过程在密闭的环境中，降低污染环境的几率，使用后方便进行CIP和SIP。
[0018]优选地，所述裂解螺旋管内径为0.5cm
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15cm，优选为0.5cm
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6cm；所述第一混合泵和第二混合泵的泵头直径均为2cm
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100cm，优选为4cm
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30cm。
[0019]优选地，所述第一混合泵和第二混合泵的叶轮均包括后盖板；所述后盖板上均匀分布有多个导流柱，所述导流柱上至少沿叶轮旋转方向的外侧面呈弧面设置。
[0020]优选地，所述导流柱为圆柱、圆台或扇形柱的一种或多种本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于提取细菌中质粒DNA的方法，其特征在于，在两个串联的混合组件中实现质粒DNA生产过程中的裂解和中和，具体包括以下步骤：(1)混合；(2)裂解；(3)中和；其中，步骤(1)在第一混合组件中完成，步骤(2)在裂解螺旋管中完成，步骤(3)在第二混合组件中完成，所述第一混合组件、裂解螺旋管和第二混合组件依次串联。2.根据权利要求1所述的用于提取细菌中质粒DNA的方法，其特征在于，所述第一混合组件的转速为50rpm
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1500rpm，优选为200rpm
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500rpm；所述第二混合组件的转速为20rpm
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1000rpm，优选为150rpm
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500rpm。3.根据权利要求1所述的用于提取细菌中质粒DNA的方法，其特征在于，所述第一混合组件和第二混合组件的结构各自独立地选自搅拌式、乳化式和离心式中的任一种，所述第一混合组件和第二混合组件均优选为混合泵或搅拌器；优选地，所述第一混合组件为搅拌式或乳化式，所述第二混合组件为离心式。4.根据权利要求3所述的用于提取细菌中质粒DNA的方法，其特征在于，所述第一混合组件和第二混合组件分别为第一混合泵和第二混合泵，所述第一混合泵和第二混合泵的泵腔体积与单个混合泵额定每分钟进料体积的比值范围均为1：6
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1:1，优选为1:6
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1:3；或所述第一混合泵和第二混合泵的泵腔体积均为料液流经泵腔内10s
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60s的体积，优选为料液流经泵腔内10s
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20s的体积。5.根据权利要求4所述的用于提取细菌中质粒DNA的方法，其特征在于，所述裂解螺旋管内径为0.5cm
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15cm，优选为0.5cm
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6cm；所述第一混合泵和第二混合泵的泵头直径均为2cm
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100cm，优选为4cm
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30cm。6.根据权利要求1至5中任一项所述的用于提取细菌中质粒DNA的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨鸿凯，
申请(专利权)人：艾棣维欣苏州生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：