一种血浆样本cfDNA提取试剂组合、试剂盒及提取方法技术

本发明专利技术公开了一种血浆样本cfDNA提取试剂组合、试剂盒及提取方法，属于分子生物学技术领域。所述血浆样本cfDNA提取试剂组合包括裂解液、绑定液和磁珠分散液，进一步还包括蛋白清洗液、漂洗液和/或洗脱液。利用本发明专利技术的试剂组合或试剂盒，结合本发明专利技术的提取方法，能够从血浆样本中提取高质量高纯度的cfDNA，可作为高通量测序文库构建的样本来源。高通量测序文库构建的样本来源。高通量测序文库构建的样本来源。

【技术实现步骤摘要】
一种血浆样本cfDNA提取试剂组合、试剂盒及提取方法


[0001]本专利技术属于分子生物学
，特别地，涉及一种血浆样本cfDNA提取试剂组合、试剂盒及提取方法。

技术介绍

[0002]cfDNA(cell Free DNA)又称循环DNA，是指游离于细胞之外的DNA分子，这些DNA分子主要来源于正常细胞某些特定释放过程、细胞凋亡、细胞坏死、以及癌细胞生长浸润过程中的释放，其大小主要集中在160
‑
170到数百bp，半衰期在数小时左右。
[0003]血液中的cfDNA水平和种类与包括肿瘤在内的多种疾病相关，此外，在母体血液中也能找到胎儿的cfDNA。血液中的cfDNA检测已经被广泛用于各种癌症、某些自身免疫疾病如红斑狼疮的筛查，以及胎儿遗传疾病如唐氏综合征的无创检测。
[0004]然而，由于血浆中的cfDNA含量低，且个体差异大，加上血浆成分复杂，普通DNA提取试剂盒提取得到的cfDNA样本量少且纯度低，不能满足二代测序建库要求，极大地限制了cfDNA的临床应用。

技术实现思路

[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
[0006]本专利技术第一方面提供一种血浆样本cfDNA提取试剂组合，包括裂解液、绑定液和磁珠分散液。
[0007]所述裂解液含有2～4％SDS、50～100mM EDTA、0.5～1MTris
‑
HCl、1～2MNaCl和10～20％甘油；其中，SDS使样本中的蛋白变性沉淀，并解聚与核酸结合的核蛋白；EDTA用于抑制样本中可能存在的核酸酶，保护cfDNA；Tris
‑
HCl用于提供适合DNA稳定的PH环境；NaCl用于增加DNA溶解度，降低蛋白溶解度；甘油用于保持溶液渗透压。
[0008]所述绑定液含有40～60％异丙醇和1～2MNaCl；其中，异丙醇用于吸收溶液中水分，使核酸析出；NaCl用于提供核酸结合磁珠所需的钠离子。
[0009]所述磁珠分散液中磁珠的浓度为50
‑
80mg/mL，所述磁珠用于吸附DNA。
[0010]在本专利技术的一些实施方案中，所述EDTA和Tris
‑
HCl利用pH为8.0的母液加入。
[0011]任选地，所述血浆样本cfDNA提取试剂组合还包括蛋白清洗液，所述蛋白清洗液含有40～60％盐酸胍和40～60％无水乙醇。其中，盐酸胍用于溶解蛋白；无水乙醇用于清洗蛋白。
[0012]任选地，所述血浆样本cfDNA提取试剂组合还包括漂洗液所述漂洗液含有0.1～0.5M和60～80％无水乙醇。其中，Tris
‑
HCl同样用于提供适合DNA稳定的PH环境，无水乙醇用于清洗蛋白。
[0013]任选地，所述血浆样本cfDNA提取试剂组合还包括洗脱液，所述洗脱液为5
‑
10mM Tris
‑
HCl。优选地，所述Tris
‑
HCl的pH为8.0。
[0014]本专利技术第二方面提供一种血浆样本cfDNA提取试剂盒，包括本专利技术第一方面任一
所述的血浆样本cfDNA提取试剂组合。
[0015]特别地，在本专利技术的一个具体实施方案中，所述血浆样本cfDNA提取试剂盒包括裂解液、绑定液、磁珠分散液、蛋白清洗液、漂洗液和洗脱液，其中，所述裂解液含有2～4％SDS、50～100mM EDTA、0.5～1MTris
‑
HCl、1～2MNaCl和10～20％甘油；所述绑定液含有40～60％异丙醇和1～2MNaCl；所述磁珠分散液中磁珠的浓度为50
‑
80mg/mL；所述蛋白清洗液含有40～60％盐酸胍和40～60％无水乙醇；所述漂洗液含有0.1～0.5M和60～80％无水乙醇，所述洗脱液为5
‑
10mM Tris
‑
HCl。
[0016]本专利技术第三方面提供一种血浆样本cfDNA提取的方法，利用本专利技术第二方面特别的血浆样本cfDNA提取试剂盒进行提取，包括以下步骤：
[0017]S1，在所述血浆样本中加入0.2～0.4倍血浆样本体积的裂解液，混匀后50～80℃孵育10～20min；
[0018]S2，10000～15000g离心3～10min，吸取上清至样本管，在上清中加入2～3倍血浆样本体积的绑定液；
[0019]S3，向样本管中加入0.1～0.15倍血浆样本体积的磁珠分散液，室温孵育5～15min；
[0020]S4，将样本管置于磁力架上，室温静置3～10min，吸弃上清；
[0021]S5，向加入150～250μL的蛋白清洗液，重悬磁珠，室温静置5～15min，重复步骤S4；
[0022]S6，向样本管中加入80～150μL的漂洗液，静置10sec以上，吸弃上清并干燥；
[0023]S7，向样本管中加入10～20μL洗脱液，吹打重悬磁珠，室温静置5～15min，将样本管置于磁力架上，室温静置5～15min，吸取上清，得到cfDNA溶液。
[0024]在本专利技术的一些实施方案中，步骤S1中，在所述血浆样本中加入0.25～0.3倍血浆样本体积的裂解液。
[0025]在本专利技术的一些实施方案中，步骤S1中，混匀后70℃金属浴孵育15min。
[0026]本专利技术的有益效果
[0027]相对于现有技术，本专利技术具有以下有益技术效果：
[0028]利用本专利技术的试剂组合或试剂盒，结合本专利技术的提取方法，能够从血浆样本中提取高质量高纯度的cfDNA，可作为高通量测序文库构建的样本来源，解决了血浆cfDNA提取得率低、纯度低的难题。
附图说明
[0029]图1示出了利用本专利技术的试剂组合提取得到的样本11的cfDNA质控结果。
[0030]图2示出了利用本专利技术的试剂组合提取得到的样本12的cfDNA质控结果。
[0031]图3示出了利用本专利技术的试剂组合提取得到的样本11的cfDNA建立的文库质控结果。
[0032]图4示出了利用本专利技术的试剂组合提取得到的样本12的cfDNA建立的文库质控结果。
[0033]图5示出了利用商业试剂盒提取得到的样本11的cfDNA质控结果。
[0034]图6示出了利用商业试剂盒提取得到的样本12的cfDNA质控结果。
具体实施方式
[0035]除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的相关术语的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。
[0036]本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血浆样本cfDNA提取试剂组合，其特征在于，包括裂解液、绑定液和磁珠分散液，其中，所述裂解液含有2～4％SDS、50～100mM EDTA、0.5～1MTris
‑
HCl、1～2MNaCl和10～20％甘油；所述绑定液含有40～60％异丙醇和1～2MNaCl；所述磁珠分散液中磁珠的浓度为50
‑
80mg/mL。2.根据权利要求1所述的血浆样本cfDNA提取试剂组合，其特征在于，还包括蛋白清洗液，所述蛋白清洗液含有40～60％盐酸胍和40～60％无水乙醇。3.根据权利要求1所述的血浆样本cfDNA提取试剂组合，其特征在于，还包括漂洗液所述漂洗液含有0.1～0.5M和60～80％无水乙醇。4.根据权利要求1所述的血浆样本cfDNA提取试剂组合，其特征在于，还包括洗脱液，所述洗脱液为5
‑
10mM Tris
‑
HCl。5.一种血浆样本cfDNA提取试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～4任一所述的血浆样本cfDNA提取试剂组合。6.一种血浆样本cfDNA提取试剂盒，其特征在于，包括裂解液、绑定液、磁珠分散液、蛋白清洗液、漂洗液和洗脱液，其中，所述裂解液含有2～4％SDS、50～100mM EDTA、0.5～1MTris
‑
HCl、1～2MNaCl和10～20％甘油；所述绑定液含有40～60％异丙醇和1～2MNaCl...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁洪，郎秋蕾，李璐璐，
申请(专利权)人：杭州联川生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：