血浆中提取游离DNA的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其是血浆中提取游离DNA的方法。该方法的具体步骤为，a、取血浆样本置于离心管内，然后在离心管内加入蛋白酶K和裂解液，并将离心管进行涡轮旋转或振荡混合均匀；b、将混合均匀的裂解混合物进行水浴，得到初级混合液；c、将初级混合液与结合液进行混合，再将离心管静置在磁力架上进行磁珠分离，并倒掉离心管内的废液，保留磁珠；d、再在离心管内倒入浓度为75％

【技术实现步骤摘要】
血浆中提取游离DNA的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是血浆中提取游离DNA的方法。

技术介绍

[0002]游离DNA也叫cell free DNA，一般存在于血浆、血清、胸腹水、脑脊液等样本中，含量较少。血浆是血液除去血细胞和血小板外的液体组分，约占全血体积的50
‑
60％。通过抗凝采血管采集血液，离心后收集到的上层淡黄色液体即为血浆。Mandel等人在1948年首次报道了血浆中游离DNA(cell free DNA，cfDNA)的存在，它是一种胞外DNA，主要是由单链或双链DNA以及单链与双链DNA的混合物组成。健康人和肿瘤患者外周血中均存在cfDNA，而肿瘤患者外周血中cfDNA的含量约为健康人的10倍以上。床研究表明，cfDNA能有效反映患者整体的肿瘤负荷、恶性程度、转移能力以及实时的基因突变信息。现有的游离DNA提取方法有化学法和吸附法，但是现有的提取方法的提取纯度不高。

技术实现思路

[0003]本专利技术要解决的技术问题是：为了解决
技术介绍
中描述的技术问题，本专利技术提供了一种血浆中提取游离DNA的方法。通过蛋白酶K和裂解液来裂解血浆样本，通过结合液的混合，配合乙醇与漂洗液对磁珠进行清洗，通过洗脱液让磁珠进行磁分离，从而提高了游离DNA的提取纯度。
[0004]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0005]一种血浆中提取游离DNA的方法，该方法的具体步骤为：
[0006]a、取血浆样本置于离心管内，然后在离心管内加入蛋白酶K和裂解液，并将离心管进行涡轮旋转或振荡混合均匀；
[0007]b、将混合均匀的裂解混合物进行水浴，得到初级混合液；
[0008]c、将初级混合液与结合液进行混合，再将离心管静置在磁力架上进行磁珠分离，并倒掉离心管内的废液，保留磁珠；
[0009]d、再在离心管内倒入浓度为75％
‑
85％的乙醇，并将离心管内的乙醇和磁珠混合；
[0010]e、用漂洗液对磁珠进行清洗；
[0011]f、将洗脱液放入离心管内，然后将离心管置于磁力架上进行磁分离，最后将离心管内的上清液吸出，上清液即为游离DNA。
[0012]具体地，所述裂解液由如下重量份数的组分组成：盐酸胍3
‑
5份、异硫氰酸胍0.8
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2.5份、碘化钠1
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3份、异丙醇10
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20份、水2
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5份。
[0013]具体地，所述结合液由如下重量份数的组分组成：盐酸胍7
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13份、柠檬酸1
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3份、异丙醇20
‑
50份、乙酸1
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4份、EDTA 5
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8份。
[0014]具体地，所述漂洗液由如下重量份数的组分组成：异硫氰酸胍5
‑
10份、碘化钠2
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6份。
[0015]具体地，所述洗脱液由如下重量份数的组分组成：Tris
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HCl 5
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8份、EDTA1
‑
3份、三
羟甲基氨基甲烷6
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12份。
[0016]具体地，步骤a中，所述血浆样本与裂解液的比例为1：4，所述涡轮旋转的转速为8000
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9500rpm。
[0017]具体地，步骤b中，所述水浴温度为55
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60摄氏度，水浴时间为1
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1.2小时。
[0018]具体地，步骤c中，所述初级混合液与结合液的混合方式为离心混合，离心转速为10000
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12000rpm，离心时间为50秒。
[0019]具体地，步骤d中，所述乙醇和磁珠混合摇匀的混合方式为离心混合，离心转速为11000
‑
13000rpm，离心时间为1分钟。
[0020]具体地，步骤f中，所述离心管磁分离的时间为2
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4分钟，上清液通过吸管吸出。
[0021]本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种血浆中提取游离DNA的方法。通过蛋白酶K和裂解液来裂解血浆样本，通过结合液的混合，配合乙醇与漂洗液对磁珠进行清洗，通过洗脱液让磁珠进行磁分离，从而提高了游离DNA的提取纯度。
具体实施方式
[0022]实施例一：
[0023]一种血浆中提取游离DNA的方法，该方法的具体步骤为：
[0024]a、取血浆样本置于离心管内，然后在离心管内加入蛋白酶K和裂解液，并将离心管进行涡轮旋转或振荡混合均匀；血浆样本与裂解液的比例为1：4，所述涡轮旋转的转速为8000rpm。
[0025]裂解液由如下重量份数的组分组成：盐酸胍3份、异硫氰酸胍0.8份、碘化钠1份、异丙醇10份、水2份。
[0026]b、将混合均匀的裂解混合物进行水浴，得到初级混合液。水浴温度为55摄氏度，水浴时间为1小时。
[0027]c、将初级混合液与结合液进行混合，再将离心管静置在磁力架上进行磁珠分离，并倒掉离心管内的废液，保留磁珠；初级混合液与结合液的混合方式为离心混合，离心转速为10000rpm，离心时间为50秒。
[0028]结合液由如下重量份数的组分组成：盐酸胍7份、柠檬酸1份、异丙醇20份、乙酸1份、EDTA5份。
[0029]d、再在离心管内倒入浓度为75％的乙醇，并将离心管内的乙醇和磁珠混合；乙醇和磁珠混合摇匀的混合方式为离心混合，离心转速为11000rpm，离心时间为1分钟。
[0030]e、用漂洗液对磁珠进行清洗；
[0031]漂洗液由如下重量份数的组分组成：异硫氰酸胍5份、碘化钠2份。
[0032]f、将洗脱液放入离心管内，然后将离心管置于磁力架上进行磁分离，最后将离心管内的上清液吸出，上清液即为游离DNA。离心管磁分离的时间为2分钟，上清液通过吸管吸出。
[0033]洗脱液由如下重量份数的组分组成：Tris
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HCl 5份、EDTA 1份、三羟甲基氨基甲烷6份。
[0034]实施例二：
[0035]一种血浆中提取游离DNA的方法，该方法的具体步骤为：
[0036]a、取血浆样本置于离心管内，然后在离心管内加入蛋白酶K和裂解液，并将离心管进行涡轮旋转或振荡混合均匀；血浆样本与裂解液的比例为1：4，所述涡轮旋转的转速为9500rpm。
[0037]裂解液由如下重量份数的组分组成：盐酸胍5份、异硫氰酸胍2.5份、碘化钠3份、异丙醇20份、水5份。
[0038]b、将混合均匀的裂解混合物进行水浴，得到初级混合液。水浴温度为60摄氏度，水浴时间为1.2小时。
[0039]c、将初级混合液与结合液进行混合，再将离心管静置在磁力架上进行磁珠分离，并倒掉离心管内的废液，保留磁珠；初级混合液与结合液的混合方式为离心混合，离心转速为12000rpm，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血浆中提取游离DNA的方法，其特征是，该方法的具体步骤为：a、取血浆样本置于离心管内，然后在离心管内加入蛋白酶K和裂解液，并将离心管进行涡轮旋转或振荡混合均匀；b、将混合均匀的裂解混合物进行水浴，得到初级混合液；c、将初级混合液与结合液进行混合，再将离心管静置在磁力架上进行磁珠分离，并倒掉离心管内的废液，保留磁珠；d、再在离心管内倒入浓度为75％
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85％的乙醇，并将离心管内的乙醇和磁珠混合；e、用漂洗液对磁珠进行清洗；f、将洗脱液放入离心管内，然后将离心管置于磁力架上进行磁分离，最后将离心管内的上清液吸出，上清液即为游离DNA。2.根据权利要求1所述的血浆中提取游离DNA的方法，其特征在于：所述裂解液由如下重量份数的组分组成：盐酸胍3
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5份、异硫氰酸胍0.8
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2.5份、碘化钠1
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3份、异丙醇10
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20份、水2
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5份。3.根据权利要求1所述的血浆中提取游离DNA的方法，其特征在于：所述结合液由如下重量份数的组分组成：盐酸胍7
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13份、柠檬酸1
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3份、异丙醇20
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50份、乙酸1
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4份、EDTA 5
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8份。4.根据权利要求1所述的血浆中提取游离DNA的方法，其特征在于：所述漂洗液由如下重量份数的组分组成：异...

【专利技术属性】
技术研发人员：张帆，江赐忠，王和勇，
申请(专利权)人：苏州镒湘医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：