用于体外mRNA转录的合成DNA模板制造技术

本发明专利技术涉及用于免疫疗法或用于免疫疗法筛选的mRNA的制造。与现有方法相比，本方法无质粒、快速且便宜，其允许在免疫疗法中筛选潜在的新抗原。在的新抗原。在的新抗原。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于体外mRNA转录的合成DNA模板
专利

[0001]本专利技术涉及用于免疫疗法或用于免疫疗法筛选或监测的mRNA的制造。与现有方法相比，本方法无质粒、快速且便宜，其允许在免疫疗法中筛选潜在的新抗原。
[0002]专利技术背景
[0003]在例如癌症免疫疗法中，免疫系统被被动或主动利用来靶向并杀死癌细胞。通过这种方式，可以实现比常规癌症治疗药更高的对恶性细胞的特异性。因此，这种方法避免了脱靶毒性，同时仍能诱导高效的抗癌反应。
[0004]在主动免疫疗法中，免疫细胞被刺激并被引导以主动对抗癌症，虽然更具挑战性，但这种方法非常有前景。主动免疫疗法高度依赖于对抗原特异性免疫细胞、例如杀伤性T细胞和产生抗体的B细胞的有效刺激。一种体内诱导T细胞反应的方法是基于它们与抗原呈递细胞(APC)、特别是树突状细胞(DC)的相互作用，这些细胞经过修饰以在其表面呈递靶抗原时具有增强的免疫刺激特征。
[0005]在抗原呈递细胞的修饰中，编码免疫刺激性抗原的mRNA被引入需要制造编码mRNA的APC。在本方法中，mRNA免疫疗法是基于在产生RNA之前将靶抗原肽克隆到质粒载体中。这需要将编码免疫刺激抗原的mRNA组合成串联小基因中的一串抗原，克隆到用于体外转录的细菌质粒载体中。这种标准的实验室程序需要长时间的工作方案，包括充分的质粒筛选和高成本的试剂，导致最终产品中可能存在细菌污染的风险。
[0006]因此，需要一种用于制造用于免疫疗法或用于免疫疗法筛选或监测的mRNA的替代方法。
[0007]专利技术概述r/>[0008]在解决上述问题时，本专利技术改为利用掺入单一抗原的无质粒合成DNA模板用于体外转录和制造用于免疫疗法或用于免疫疗法筛选的mRNA。
[0009]以3种合成寡核苷酸的组装PCR制备无质粒合成DNA模板(SDT)，其特征在于，所述合成寡核苷酸包含：
[0010]‑
编码RNA聚合酶的寡核苷酸(寡核苷酸1)；
[0011]‑
编码3'非翻译区(3'UTR)的寡核苷酸(寡核苷酸3)；和
[0012]‑
编码感兴趣抗原的寡核苷酸(寡核苷酸2)，其含有重叠，所述重叠分别与编码RNA聚合酶启动子的寡核苷酸和编码3'UTR的寡核苷酸桥接。
[0013]在一个实施方案中，寡核苷酸1中使用的RNA聚合酶启动子是选自包括T7启动子、SP6启动子和T3启动子的列表的RNA聚合酶；更特别是T7启动子；甚至更特别是修饰的RNA聚合酶T7启动子。
[0014]寡核苷酸3包含在翻译终止和转录后修饰中很重要的也被称为尾序列的3'非翻译区(3'UTR)；在一个具体的实施方案中，寡核苷酸3包含编码RNA稳定剂序列的3'UTR，例如来自兔β珠蛋白的3'UTR。为了进一步稳定mRNA，寡核苷酸3可进一步包括编码3'多A尾的序列。
[0015]在一个实施方案中，寡核苷酸3进一步包含将膜蛋白和非膜蛋白都引导至细胞中的内体区室(例如溶酶体)的运输结构域；特别是细胞质内体/溶酶体靶向信号，其有效地将
抗原靶向该区室。在一个具体实施方案中，寡核苷酸3包含LAMP多肽的腔结构域，例如LAMP
‑
1、LAMP
‑
2多肽或DC LAMP多肽。
[0016]在另一个实施方案中，寡核苷酸1进一步包含5'非翻译区(5'UTR)以及用于调节真核细胞中转录物翻译的前导序列或前导RNA；特别是编码翻译增强子的5'UTR，例如β球蛋白增强子启动子。
[0017]由于抗原呈递细胞中编码抗原的正确运输在免疫疗法中很重要，因此可以在用于制造合成DNA模板的任一合成寡核苷酸中包括进一步的翻译增强剂。在一个具体实施方案中，寡核苷酸1进一步包含内质网(ER)信号序列以促进蛋白质转移到ER中，例如人LMP1的信号序列。
[0018]因此，一方面，本专利技术提供了通过如本文提供的3种合成寡核苷酸的组装PCR获得的无质粒合成DNA模板(SDT)；更特别地，所述无质粒SDT在制造用于免疫疗法或用于免疫疗法筛选的mRNA中的用途。
[0019]在另一个方面，本专利技术提供了一种制造用于免疫疗法或用于免疫疗法筛选的mRNA的方法，所述方法包括如本文提供的3种合成寡核苷酸的组装PCR，产生对应于用于mRNA分子的体外转录(iVT)的无质粒合成DNA模板(SDT)的无质粒dsDNA组装PCR产物。因此，在一个实施方案中，制造mRNA的方法进一步包括从组装PCR反应获得的无质粒SDT的iVT。任选地，在iVT之前通过PCR扩增无质粒dsDNA组装PCR分子。
[0020]因此，在一个具体实施方案中，本专利技术提供了一种无质粒制造用于免疫疗法或用于免疫疗法筛选的mRNA的方法，所述方法包括：
[0021]·
包括如本文提供的3种合成寡核苷酸的组装PCR，产生无质粒dsDNA组装PCR产物；
[0022]·
对所述组装PCR产物进行PCR扩增，产生无质粒SDT扩增产物；和
[0023]·
所述无质粒SDT扩增产物的无质粒iVT。
[0024]在一个实施方案中，SDT扩增产物的无质粒iVT是使用具有RNA聚合酶和聚合酶A的核苷5
‑
三磷酸(NTP)组合(mix)进行足以产生mRNA产物的时间；特别是具有选自SP6、T3和T7 RNA聚合酶的RNA聚合酶；更特别是使用具有T7 RNA聚合酶和聚合酶A的核苷5
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三磷酸(NTP)组合。在下文实例中，iVT在37℃进行2小时。
[0025]在一个实施方案中，SDT扩增产物的无质粒iVT进一步包括通过DNA酶处理来降解SDT，用LiCl沉淀mRNA产物。换言之，在SDT扩增产物的无质粒iVT中，由SDT与具有RNA聚合酶和聚合酶A的NTP组合反应获得的mRNA产物通过DNA酶处理(以降解SDT)进一步纯化；特别是DnasI处理，然后是LiCl(2.5M)沉淀，去除上清液。mRNA沉淀用冰冷的70％乙醇洗涤，干燥，溶于水，过滤，使用前于
‑
80℃保存。
[0026]附图简要说明
[0027]图1：上图：A：用于mRNA共转录加帽的CleanCap(cCAP)试剂AG(m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG)。B：SNA
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mRNA的结构。mRNA编码单一新抗原，其N端侧接信号肽(SP)，C端侧接内体运输结构域(DC
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Lamp)。mRNA由5'和3'UTR和多A尾稳定。
[0028]图2：单一新抗原设计。每个小基因编码一个27聚体(该图中的27聚体代表一个随机序列)，其包含位于中心位置的突变氨基酸，在其N端和COOH端侧侧接野生型序列的13个氨基酸。
[0029]图3：制造工艺流程图。
[0030]图4：合成DNA模板(SDT)(中间体I和II)的示意图。
[0031]图5：SDT SNA
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mRNA。三种合成的脱氧核糖核酸寡本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.以3种合成寡核苷酸的组装PCR制备的无质粒合成DNA模板(SDT)，其特征在于，所述合成寡核苷酸包含：
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编码RNA聚合酶启动子的寡核苷酸(寡核苷酸1)；
‑
编码3'非翻译区(3'UTR)的寡核苷酸(寡核苷酸3)；和
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编码感兴趣抗原的寡核苷酸(寡核苷酸2)，其含有重叠，所述重叠分别与编码RNA聚合酶的寡核苷酸和编码用于抗原呈递的序列的寡核苷酸桥接。2.根据权利要求1所述的SDT，其中寡核苷酸1中使用的RNA聚合酶启动子是选自包括T7启动子、SP6启动子和T3启动子的列表的RNA聚合酶启动子；更特别是T7启动子；甚至更特别是修饰的RNA聚合酶T7启动子。3.根据权利要求1所述的SDT，其中寡核苷酸3包含编码RNA稳定剂序列的3'UTR，例如来自兔β珠蛋白的3'UTR。4.根据权利要求1所述的SDT，其中寡核苷酸3可进一步包括编码3'多A尾的序列。5.根据权利要求2所述的SDT，其中寡核苷酸1进一步包含用于调节真核细胞中转录物翻译的也被称为前导序列或前导RNA的5'非翻译区(5'UTR)；特别是编码翻译增强子的5'UTR，例如β球蛋白增强子启动子。6.根据权利要求3所述的SDT，其中寡核苷酸3进一步包含用于抗原呈递的序列，例如将膜蛋白和非膜蛋白都引导至细胞中的内体区室(例如溶酶体)的运输结构域；特别是细胞质内体/溶酶体靶向信号，其有效地将抗原靶向该区室；在一个具体实施方案中，寡核苷酸3包含LAMP多肽的腔结构域，例如LAMP
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1、LAMP
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2多肽或DC LAMP多肽。7.根据权利要求2所述的SDT，其中寡核苷酸1进一步包含内质网(ER)...

【专利技术属性】
技术研发人员：K，
申请(专利权)人：米尼奥股份有限公司，
类型：发明
国别省市：