一种沉积物表面生物膜提取及半定量分析的方法技术

本发明专利技术涉及一种沉积物表面生物膜提取及半定量分析的方法，尤其涉及沉积物中吸附态有机污染物的微生物利用机制的研究方法。主要流程如下：取泥水混合物在4℃下的甲醛

【技术实现步骤摘要】
一种沉积物表面生物膜提取及半定量分析的方法


[0001]本专利技术涉及沉积物表面生物膜提取及半定量分析的方法，尤其涉及沉积物中吸附态有机污染物的微生物利用机制的研究方法。

技术介绍

[0002]IUPAC在2012年将生物膜被定义为“一种微生物的聚集体，其中细胞通常嵌入到相互粘附和/或粘附于其他表面的自产胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances，EPS)基质中。生物膜的主要成分是水(可达97％)，以及结构和功能成分，包括可溶性、凝胶状多糖，蛋白质和细胞外DNA；以及不溶性成分，例如淀粉样蛋白、纤维素、菌毛、纤毛和鞭毛。
[0003]有研究表明，当沉积物中微生物种群受到有机污染物的胁迫时，各物种的生物量都会明显增加从而聚集形成生物膜，这说明微生物可以通过形成生物膜这种方式附着在沉积物上来抵抗有机污染物的毒性，或者将其当做碳源来利用。
[0004]目前，关于生物膜的提取及定量分析的方法大多集中在纯液相体系中，而对于在沉积物中提取生物膜并定量分析的方法报道及专利很少，由于受沉积物的理化性质及吸附作用的影响，因此很难在沉积物表面提取生物膜并定量分析。所以如何在沉积物表面提取生物膜并进行定量分析，以帮助研究沉积物中吸附态有机污染物的毒性及微生物利用机制是本领域需要解决的技术问题。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供一种沉积物表面生物膜提取及半定量分析的方法。
[0006]需要说明的是，结晶紫是一种碱性染料，它可以和细胞核中的DNA结合，从而产生细胞核染色。结合此原理，如果将结晶紫充分染色沉积物表面的生物膜，再利用合适的溶剂如乙醇将其洗脱，测定其吸光度，吸光度大小即可用来表示生物膜的含量的多少。事实上，有很多研究报道沉积物可以通过自身的理化性质(如有机质、含氧官能团、孔容孔径)吸附结晶紫，这可能会导致结晶紫由于过多的被沉积物吸附，而染色在生物膜上的量很少甚至没有，从而造成结果存在较大的偏差。因此，本专利技术以结晶紫染色的原理为基础，通过超声破碎和离心以排除沉积物对染色的干扰后，再利用结晶紫对生物膜的细胞核DNA进行染色，先后利用超纯水和95％乙醇以洗去未成功和成功染色的结晶紫，在590nm的波长下测定结晶紫的吸光度即可用来表示生物膜的含量。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0008]一种沉积物表面生物膜提取及半定量分析的方法，具体包括如下步骤：
[0009](1)取5mL泥水混合物(由湿沉积物和水组成)在4～8℃(该温度范围内微生物代谢活动减弱但仍可保持活性)下的4％(m/v)甲醛
‑
0.7％(m/v)氯化钠固定液中固定24h。
[0010](2)将固定后的泥水混合物以2500rpm离心12～15min以去除浮游微生物，加入5mL超纯水并超声破碎3～5min，以3200rpm离心12～15min后取0.2mL上层液体，加入1mL 0.2％
(m/v)结晶紫溶液在4～8℃下染色1～2h(经前期实验证明，染色1～2h效果最佳，时间不宜过长或过短，会造成结晶紫染色不完全及较难洗脱，另外在4～8℃下微生物代谢活动减弱，凋亡速度减慢，但仍可保持活性，这样可以保证生物膜的量尽可能准确)；染色完成后以14000rpm离心4～6min，弃去上层液体并用超纯水洗涤2～3次以洗去未成功染色上去的结晶紫。
[0011](3)最后沉淀用95％乙醇(v/v)洗脱后测定洗脱液在590nm处的吸光度，基于沉积物的干重使用A
590
表示生物膜量(g
‑1)。
[0012]需要说明的是，本专利技术首先利用细胞固定液将沉积物表面生物膜固定后，其次采用超声破碎将沉积物及生物膜破碎处理，最后结合结晶紫染色的原理对破碎出的细胞核DNA进行染色，利用95％乙醇洗脱结晶紫并测吸光度，以此来达到半定量分析生物膜的目的。本专利技术为研究沉积物中吸附态有机污染物的毒性以及微生物利用机制提供了理论方法和技术支持。
[0013]且，值得说明的是，在去除浮游微生物及细胞破碎后离心分离时，若离心效果不好(如上清液过于浑浊)可适当提高离心时间(12～15min)。
[0014]可选地，超纯水添加量与泥水混合物的体积比为1:1，超纯水及95％乙醇的用量根据洗脱效果来定，结晶紫若经超纯水多次洗涤后仍未洗下来即为染色成功。
[0015]可选地，95％乙醇(v/v)洗脱的具体操作步骤为：加入95％乙醇(v/v)后，(从1.5mL离心管转移到50mL离心管)涡旋混匀后用95％乙醇定容到刻度45mL，以5500rpm离心10min。
[0016]经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术提供的一种沉积物表面生物膜提取及半定量分析的方法，具有如下优异效果：
[0017]1)本专利技术排除了沉积物对结晶紫吸附的影响，从而使得结晶紫可以更好地对沉积物表面生物膜微生物的DNA进行染色。
[0018]2)本专利技术解决了目前对于生物膜的量化大多只在纯液相体系中进行的不足。
[0019]3)本专利技术特别适用于在实验室条件下研究沉积物中吸附态有机污染物的毒性以及微生物利用机制；其中，所述的有机污染物是疏水性有机污染物壬基酚。
附图说明
[0020]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0021]图1为不同沉积物中生物膜含量的变化及颜色对比。
具体实施方式
[0022]下面将结合本专利技术实施例及说明书附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0023]本专利技术实施例公开了一种沉积物表面生物膜提取及半定量分析的方法。
[0024]为更好地理解本专利技术，下面通过以下实施例对本专利技术作进一步具体的阐述，但不可理解为对本专利技术的限定，对于本领域的技术人员根据上述
技术实现思路
所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本专利技术的保护范围内。
[0025]下面，将结合具体实施例，对本专利技术的技术方案作进一步的说明。
[0026]实施例1
[0027]受壬基酚(NP)胁迫下不同沉积物表面生物膜的提取：
[0028]取5mL泥水混合物(由湿沉积物和水组成)在4℃下的4％(m/v)甲醛
‑
0.7％(m/v)氯化钠固定液中固定24h，随后以2500rpm离心12min以去除浮游微生物，加入5mL超纯水并超声破碎3min，以3200rpm离心10min后取0.2mL上层液体，加入1mL 0.2％(m/v)结晶紫溶液在4℃下染色1h；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种沉积物表面生物膜提取及半定量分析的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：(1)取泥水混合物在4～8℃下的4％(m/v)甲醛
‑
0.7％(m/v)氯化钠固定液中固定24h；(2)将固定后的泥水混合物以2500rpm离心12～15min以去除浮游微生物，加入超纯水并超声破碎3～5min，以3200rpm离心12～15min后取0.2mL上层液体，加入1mL 0.2％(m/v)结晶紫溶液在4～8℃下染色1～2h；待染色完成后以14000rpm离心4～6min，弃去上层液体并用超纯水洗涤2～3次以洗去未成功染色上去的结晶紫；(3)沉淀用...

【专利技术属性】
技术研发人员：程广焕，张啸跃，李锋，王子齐，张高愿，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：