一种核酸提取裂解/结合液、核酸提取溶液体系及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种核酸提取裂解/结合液、核酸提取溶液体系及试剂盒。所述核酸提取裂解/结合液包括：2

【技术实现步骤摘要】
一种核酸提取裂解/结合液、核酸提取溶液体系及试剂盒


[0001]本专利技术涉及核酸提取
，具体涉及一种核酸提取裂解/结合液、核酸提取溶液体系及试剂盒。

技术介绍

[0002]分子诊断以核酸作为检测对象，主要应用于临床各科的诊断中，如肿瘤、感染、遗传等方面，所有工作的基础是核酸提取。在特定条件下，固相载体磁珠表面包被有如硅基、氨基或羧基等，或固相硅胶膜载体，依靠静电、疏水和氢键作用，可实现核酸与磁珠的特异性结合，通过若干次洗涤实现非特异性杂质、盐类等的去除，然后将核酸从固相载体上洗脱下来实现提纯。
[0003]磁珠、硅胶膜固相载体上一般会残留一定量的蛋白、大分子和盐类，清洗步骤有助于去除这些杂质。通常有两种清洗方式，因样本而异。对于进行血浆cfDNA(游离DNA)的提取，通常分为两步洗涤，第一步会用中等浓度的离液盐和醇去除蛋白质，然后用乙醇清洗以除去盐类。通过相关产品说明书和公开的化学品安全说明书(MSDS)，表1总结了目前市面常见的cfDNA提取试剂盒的操作和各组分情况。
[0004]表1
[0005][0006]常规基于固相载体法的核酸提取试剂盒通常以高浓度胍盐和蛋白酶K进行样本的裂解，然后以乙醇、异丙醇等一元醇作为结合液，并且后续的洗涤液中基本都含有乙醇成分。对于裂解液，阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate，SDS)能够有效变性蛋白，破坏DNA与蛋白质间静电作用从而使二者分离。作为一种高离液盐，异硫氰酸胍的存在有助于蛋白质的变性和裂解，同时对于核酸与硅基质的结合至关重要。并且为增强两者的吸附强度，通常在结合阶段还需加入乙醇或异丙醇。由于SDS和异硫氰酸胍难于互溶，而在结合阶段直接加入乙醇通过又会干扰SDS、异硫氰酸胍和蛋白的裂解效果，这些流程通常都是分步进行，比如先通过SDS和蛋白酶K的初步裂解，然后加入含胍盐的溶液进一步裂解，再加入含醇的结合液进行结合依次完成。
[0007]SDS在高浓度胍盐中难于溶解，而SDS又是一种强烈的蛋白变性剂，能够破坏其疏水作用，打开氢键并与之结合成蛋白质
‑
SDS复合结构。胍盐则可以溶解蛋白质，导致细胞结构破坏，核蛋白二级结构破坏，从而尽可能的去除蛋白等杂质，获得高纯度的DNA。然而，在常规条件下，由于SDS在高盐溶液中溶解度很低，SDS与胍盐难于协同作用以达到最佳裂解状态。当前针对血浆cfDNA的提取试剂很难实现将SDS和胍盐裂解在一步融合以实现最佳协同效果，同时操作步骤繁多复杂。另一方面，通常裂解/结合液，洗涤液中大量含有乙醇，易燃、易爆、易挥发，非常不利于生产和运输，增加附加成本。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于，提供一种核酸提取裂解/结合液及试剂盒和应用。本专利技术要解决的技术问题之一，是配制一种SDS和胍盐混溶的溶液体系形成高效的核酸提取裂解/结合液。本专利技术要解决的技术问题之二，是提出一套用于血浆cfDNA提取的试剂体系，各组分均不含有乙醇等任何易燃液体，从而弱化生产和运输的复杂性并降低成本。
[0009]本专利技术为实现上述目的所采用的技术方案如下：
[0010]一种核酸提取裂解/结合液，所述裂解/结合液包括：2
‑
5M异硫氰酸胍、0.1
‑
4％SDS、5
‑
40％N
‑
甲基乙酰胺、10
‑
50％四甘醇。其中，异硫氰酸胍也称硫氰酸胍；裂解/结合液的溶液体系为水溶液；涉及的百分比对于固态物质为质量体积比，对于液体物质则为体积体积比。此处，SDS和N
‑
甲基乙酰胺为固体，四甘醇为液体。
[0011]作为优选实施方案，所述裂解/结合液包括：3
‑
5M异硫氰酸胍、1
‑
2％SDS、15
‑
20％N
‑
甲基乙酰胺、20
‑
30％四甘醇。
[0012]作为优选实施方案，述裂解/结合液还包括：5
‑
20％Triton X
‑
100、10
‑
100mM Tris
‑
HCl、0
‑
50mM EDTA
·
2Na、0.1
‑
5mg/mL硅羟基磁珠，所述Tris
‑
HCl的pH范围为6
‑
9。
[0013]作为优选实施方案，述裂解/结合液还包括：7.5
‑
10％Triton X
‑
100、25
‑
50mM Tris
‑
HCl、10
‑
15mM EDTA
·
2Na、0.5
‑
1mg/mL硅羟基磁珠，所述Tris
‑
HCl的pH范围为7.5
‑
8.5。
[0014]本专利技术还提供一种核酸提取溶液体系，该溶液体系包括：所述的核酸提取裂解/结合液、蛋白酶K、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液；
[0015]所述蛋白酶K的浓度范围：15
‑
25mg/mL；
[0016]所述洗涤液1的成分和浓度范围为：1
‑
3M异硫氰酸胍、100
‑
500mM NaCl、0
‑
2％Triton X
‑
100、15
‑
40％四甘醇；
[0017]所述洗涤液2的成分和浓度范围为：50
‑
200mM NaCl、5
‑
20mM Tris
‑
HCl、50
‑
80％四甘醇，所述Tris
‑
HCl的pH范围为6
‑
7；
[0018]所述洗脱液的成分和浓度范围为：5
‑
20mM Tris
‑
HCl，所述Tris
‑
HCl的pH范围为6
‑
8。
[0019]本专利技术还提供了所述的核酸提取溶液体系提取血浆cfDNA的方法，包括如下步骤：
[0020]1)裂解/结合：血浆样本中加入蛋白酶K和本专利技术所述的核酸提取裂解/结合液，在0
‑
60℃的条件下孵育裂解；所述核酸提取裂解/结合液中包含硅羟基磁珠。
[0021]2)洗涤步骤1：收集磁珠，去除裂解液，加入洗涤液1，进行震荡洗涤；
[0022]3)洗涤步骤2：收集磁珠，去除洗涤液1，加入洗涤液2，进行震荡洗涤；
[0023]4)洗涤步骤2：收集磁珠，去除洗涤液2，加入洗脱液，静置；
[0024]5)洗脱步骤：收集磁珠，去除全部溶液，加入洗脱液，震荡洗脱，然后收集洗脱液，即为提取的cfDNA。
[0025]作为优选实施方案，所述步骤1)中蛋白酶K的体积加入量为血浆样本的0.04
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸提取裂解/结合液，其特征在于，所述裂解/结合液包括：2
‑
5M异硫氰酸胍、0.1
‑
4％SDS、5
‑
40％N
‑
甲基乙酰胺、10
‑
50％四甘醇。2.如权利要求1所述的一种核酸提取裂解/结合液，其特征在于，所述裂解/结合液包括：3
‑
5M异硫氰酸胍、1
‑
2％SDS、15
‑
20％N
‑
甲基乙酰胺、20
‑
30％四甘醇。3.如权利要求1所述的一种核酸提取裂解/结合液，其特征在于，所述裂解/结合液还包括：5
‑
20％Triton X
‑
100、10
‑
100mM Tris
‑
HCl、0
‑
50mM EDTA
·
2Na、0.1
‑
5mg/mL硅羟基磁珠，所述Tris
‑
HCl的pH范围为6
‑
9。4.如权利要求2所述的一种核酸提取裂解/结合液，其特征在于，所述裂解/结合液还包括：7.5
‑
10％Triton X
‑
100、25
‑
50mM Tris
‑
HCl、10
‑
15mM EDTA
·
2Na、0.5
‑
1mg/mL硅羟基磁珠，所述Tris
‑
HCl的pH范围为7.5
‑
8.5。5.一种核酸提取溶液体系，其特征在于，该溶液体系包括：权利要求1
‑
4任一项所述的核酸提取裂解/结合液、蛋白酶K、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液；所述蛋白酶K的浓度范围：15
‑
25mg/mL；所述洗涤液1的成分和浓度范围为：1
‑
3M异硫氰酸胍、100
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：王臣，谢正华，
申请(专利权)人：上海思路迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：