一种基于胆固醇修饰的脂质立方相核酸结晶方法技术

本发明专利技术提供一种基于胆固醇修饰的脂质立方相核酸结晶方法，该方法包括以下步骤：1)使用胆固醇修饰核酸，制备得到胆固醇修饰的核酸结构；2)将所述胆固醇修饰的核酸结构与脂质混合，制备得到核酸结构脂质立方相；3)将所述核酸结构脂质立方相点样到结晶板孔内，覆盖结晶试剂；4)将结晶板放置于晶体培养室中避光培养，观察结晶情况；5)捞取晶体，收集X射线衍射数据。根据本发明专利技术提出的这样一种基于胆固醇修饰的脂质立方相核酸结晶方法，相比现有技术具有快速、高效、廉价的多重优点，为加快核酸结构的解析打下了良好的基础，并为进一步推动基于核酸结构的生物医学应用提供可能性。核酸结构的生物医学应用提供可能性。核酸结构的生物医学应用提供可能性。

【技术实现步骤摘要】
一种基于胆固醇修饰的脂质立方相核酸结晶方法


[0001]本专利技术涉及核酸结晶
，更具体地涉及一种基于胆固醇修饰的脂质立方相核酸结晶方法。

技术介绍

[0002]核酸不仅是遗传信息的载体，而且可以折叠形成多种具有复杂功能和高度有序的三维结构。因此核酸不仅在生命体系中发挥着重要作用，同样可以作为生物技术和纳米技术的理想材料，具有重要的价值。核酸的结构信息对于揭示其功能作用至关重要。因此，在原子水平上测定核酸的三维结构对于加快核酸相关药物的发现、增进我们对核酸生物学功能的理解以及实现核酸纳米技术的未来发展至关重要。
[0003]X射线晶体衍射技术作为最成熟以及分辨率最高的解析方法，是目前在原子水平上研究核酸结构最有力的方法。开展核酸结构与功能研究，首先要获得高质量的核酸结构的晶体。但是，由于核酸结构的固有负电荷、高溶剂含量和结构动力学，核酸结构通常很难结晶与获得高质量的晶体。目前常规的结晶方法都是通过改变温度、浓度、缓冲条件和其他影响晶体生长的因素进行常规的试错筛选，工作量大(大量的条件筛选和繁杂的Buffer配制)，时间跨度长(几天到几个月)，费用高(需要消耗毫克级别的核酸)等问题。因此，核酸结构的结晶是X射线晶体衍射技术解析核酸结构的瓶颈环节之一。现阶段迫切需要开发一种快速高效的新型核酸结晶技术，加快核酸结构的解析速度。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种基于胆固醇修饰的脂质立方相核酸结晶方法，从而解决现有技术中核酸结构的结晶需要进行大量条件筛选造成工作量大、时间跨度长、费用高的问题。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
[0006]提供一种基于胆固醇修饰的脂质立方相核酸结晶方法，该方法包括以下步骤：1)使用胆固醇修饰核酸，制备得到胆固醇修饰的核酸结构；2)将所述胆固醇修饰的核酸结构与脂质混合，制备核酸结构脂质立方相；3)将所述核酸结构脂质立方相点样到结晶板孔内，覆盖结晶试剂；4)将步骤3)得到的结晶板放置于晶体培养室中避光培养，观察结晶情况；5)捞取晶体，收集X射线衍射数据。
[0007]根据本专利技术所提供的脂质立方相核酸结晶方法，其工作原理为：胆固醇修饰后的核酸具有类似膜蛋白的亲疏水特性，可以插入到脂立方相的脂双层中，从而堆积形成晶体。
[0008]步骤1)中所述核酸为脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。
[0009]步骤1)中所述核酸采用的溶解缓冲液中镁离子浓度为0～50mM。
[0010]步骤1)中所采用的核酸包括：单链核酸、双链核酸、核酸适配体、核酸四面体、球形核酸、核酸纳米结构。
[0011]步骤1)中所述核酸结构的浓度为0.1～10mg/mL。根据不同的核酸结构可选择最适
的浓度。针对DNA适配体结构，最适浓度为0.1～4mg/mL；针对DNA四面体和DNA纳米星，最适浓度为4～10mg/mL。
[0012]优选地，在步骤1)中核酸的浓度为0.1～10mg/mL的基础上，步骤2)中，脂质与胆固醇修饰的核酸结构混合重量比优选为(1～2):1，在此比例范围内(例如1.45:1或者1.5:1)均可以获得立方相混合物，这一比例过大或者过小(例如3:1或者0.5:1)则混合后无法获得立方相混合物。
[0013]步骤2)中所述脂质为单油酸甘油酯B，脂质β
‑
XylOC16+4或脂质phytantriol。
[0014]步骤2)中所述脂质可进一步添加天然脂质，包括胆固醇、磷脂酰胆碱。
[0015]步骤2)中所采用的混合方法包括：离心法、挥发法以及注射器混合法。其中，最佳地为气密性中空推杆式注射器混合法。
[0016]步骤3)中所采用的点样方法为移液枪法、微量注射器法或点样机器人法。
[0017]步骤3)中所述结晶试剂为结晶条件筛选试剂盒中的试剂，或者配制的结晶条件试剂。包括但不限于：Memplus，Memsys，Cubic，Memgold2，Memgold1，Memmeso等，应当理解的是，上述试剂盒都是市面上可以购买获得的膜蛋白结晶条件筛选试剂盒，均适用于本专利技术，其他试剂盒或者自己配制的结晶条件筛选试剂也可用于本专利技术。
[0018]步骤4)中所采用的培养温度为4～25℃。实际应用过程中可根据结晶效果，选择最优的温度。
[0019]步骤5)中用于收集X射线衍射数据的装置为台式X射线衍射仪或同步辐射X射线晶体学线站。其中，最佳地为同步辐射X射线晶体学线站。
[0020]脂质立方相技术是一种针对膜蛋白结晶的有效体系，而一直未用于纯核酸结构的结晶。本专利技术的创造性即在于充分利用核酸结构的易修饰性，使用胆固醇修饰改变核酸结构的亲疏水性，首次将针对膜蛋白结晶的脂质立方相技术转用于纯核酸结构的结晶。通常，对于核酸进行胆固醇修饰主要应用于核酸纳米
，具体应用于基于疏水作用力的多种核酸纳米结构的组装及生物学应用。而研究核酸结构的技术人员集中于核酸结构生物学领域，主要针对原生核酸结构(未人工修饰)解析开展工作，难以和膜蛋白结晶领域及核酸纳米
产生交叉，故即使是本领域技术人员也不易想到将核酸的胆固醇修饰与针对膜蛋白结晶的脂质立方相技术结合。而专利技术人正是基于对核酸的胆固醇修饰及应用具备较深的理解，以及多学科交叉(核酸纳米
，核酸结构生物学领域，膜蛋白结晶领域)的研究经验才首次创造性地提出了这样一种基于胆固醇修饰的脂质立方相核酸结晶方法。
[0021]众所周知，核酸结构的结晶对于更好地理解核酸结构的功能具有十分重要的意义，然而，目前核酸结构的结晶主要依赖大量的试错筛选，工作量大，时间跨度长，费用高，截止到目前为止仍没有一种晶体生长方法可以解决如上问题。本专利技术利用核酸结构易修饰的特点，首次提出将核酸结构修饰上胆固醇这种疏水基团，使得核酸结构具有类似膜蛋白的亲疏水性，进而利用脂质立方相结晶方法这种针对膜蛋白结晶的方法，实现了对核酸结构的结晶，采用该方法使得核酸结构一天内即可结晶，在所试结晶条件中结晶率高达91％以上，且仅需微克级别的核酸。
[0022]综上所述，根据本专利技术提出的这样一种基于胆固醇修饰的脂质立方相核酸结晶方法，相比现有技术具有快速、高效、廉价的多重优点，为加快核酸结构的解析打下了良好的基础，并为进一步推动基于核酸结构的生物医学应用提供可能性。
附图说明
[0023]图1是实施例1中胆固醇修饰DNA制备核酸结构的过程示意图，其中，黑色部分指示胆固醇，灰色部分指示DNA；
[0024]图2是实施例1中胆固醇修饰DNA制备核酸结构退火前后的琼脂糖凝胶电泳结果，其中，泳道1为标准分子量DNAMarker，泳道2为退火前的胆固醇修饰DNA的核酸结构，泳道3为退火后的胆固醇修饰DNA的核酸结构；
[0025]图3是实施例2中DNA适配体结构脂质立方相的制备图，其中，左图为挤压前的Monoolein和DNA适配体结构，右图为挤压后的DNA适配体结构脂质立方相；
[0026]图4示出了实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于胆固醇修饰的脂质立方相核酸结晶方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：1)使用胆固醇修饰核酸，制备得到胆固醇修饰的核酸结构；2)将所述胆固醇修饰的核酸结构与脂质混合，制备得到核酸结构脂质立方相；3)将所述核酸结构脂质立方相点样到结晶板孔内，覆盖结晶试剂；4)将步骤3)得到的结晶板放置于晶体培养室中避光培养，观察结晶情况；5)捞取晶体，收集X射线衍射数据。2.根据权利要求1所述的脂质立方相核酸结晶方法，其特征在于，步骤1)中所述核酸为DNA或RNA。3.根据权利要求1所述的脂质立方相核酸结晶方法，其特征在于，步骤1)中所采用的核酸包括：单链核酸、双链核酸、核酸适配体、核酸四面体、球形核酸、核酸纳米结构。4.根据权利要求1所述的脂质立方相核酸结晶方法，其特征在于，步骤2)中所述脂质为单油酸甘油酯B，脂质β
‑
XylOC16+4或脂质phytantriol，还可进一步添加天然脂质，包括胆固醇、磷...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔华庭，孙波，汪启胜，郁峰，徐琴，
申请(专利权)人：中国科学院上海高等研究院，
类型：发明
国别省市：