一种突变的马达蛋白及其应用、试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种突变的马达蛋白及其应用、试剂盒。通过特定的突变降低马达蛋白的量，增加了马达蛋白对DNA模板底物的亲和力，减慢了马达蛋白的解链速度，从而能够精确调控该马达蛋白与DNA聚合酶之间的功能协作，进而使其在核酸扩增中的应用，如基于突变马达蛋白的体外模拟等温扩增技术，尤其是低拷贝DNA模板时达到检测灵敏度更高的效果。达到检测灵敏度更高的效果。

【技术实现步骤摘要】
一种突变的马达蛋白及其应用、试剂盒


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种突变的马达蛋白及其应用和试剂盒。

技术介绍

[0002]马达蛋白是分布于细胞内部或细胞表面的一类蛋白质，负责细胞内部分物质或整个细胞的宏观运动。生物体内的各种组织、器官乃至整个个体的运动最终都可归结为分子马达在微观尺度上的运动。分子马达将化学键中的能量耦合转化为动能。而化学键中的能量最终来源于细胞膜或线粒体膜内外的电化学梯度。
[0003]解旋酶是一种常见的马达蛋白。它以单链核酸为轨道沿着核酸链定向移动，并能够解开双链核酸之间的氢键。一般由水解ATP供应能量来行使解开氢键的功能。一般在生物体内DNA或RNA复制过程中起到催化双链DNA或RNA解旋的作用。解旋酶在生物体内参与多种细胞过程，如DNA复制、转录、重组、DNA修复等。在细菌中解旋酶的种类很多，都具有ATP酶的活性。大部分的移动方向是5
’
到3
’
,但也有3
’
到5
’
方向移动的。细菌中丰富的解旋酶种类为我们发现、开发高性能酶从而行使各种细胞外功能提供了丰富的研究来源。
[0004]DNA的体外扩增目前最成熟最常用的技术是PCR(聚合酶链式反应)技术。该技术具体描述为在目的扩增区两端设计一对引物，耐热的DNA聚合酶在合适的离子、pH条件下通过变性、退火、延伸为一个温度循环使用原料dNTP不断产生新的目的扩增片段。PCR扩增技术需要特定的热循环仪器(PCR仪)来进行，因此为了满足不同情境下的需求，科学家们相继开发出了多种不需要热循环仪器的等温扩增技术，如RPA(重组酶聚合酶扩增技术)、LAMP(环介导等温扩增技术)、RCA(滚环扩增技术)、HDA(依赖解旋酶的等温扩增技术)等。它们使用不同的方式来使DNA双链解链并使引物结合到模板上。RPA(重组酶聚合酶扩增技术)技术依赖于同源重组酶RecA或者T4Uvsx与引物形成复合物，复合物在双链DNA上进行引物的同源序列搜寻，当搜寻到与引物序列一致的模板序列时即将该部分的双链模板打开从而使引物结合上去，继而进行聚合酶延伸，从而完成扩增。我们在实验测试中惊奇地发现该技术的一个致命缺点，即同源重组酶RecA或者T4Uvsx不能够对DNA和RNA的杂合链进行序列搜寻并插入引物。因此对RNA的逆转录产物(DNA和RNA的杂合链)进行扩增时其扩增灵敏度非常低。LAMP(环介导等温扩增技术)技术依赖于比较高的反应温度，如60℃
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65℃之间。在该比较高的反应温度时双链DNA的“呼吸作用”会加强。也就是说在该温度时双链DNA会偶尔部分解链成部分单链，过一会儿会再自动变成双链。在单链和双链互相转换的过程中就为引物的结合提供了机会。在该技术方案中DNA发生“呼吸作用”的机会本身就不高并且不可控，因此其扩增灵敏度也不高。并且在扩增DNA和RNA的杂合链方面也同样有劣势。因为DNA和RNA的杂合链相比于DNA和DNA形成的双链结合更加稳定，更不容易发生“呼吸作用”。因此，其扩增灵敏度又会变低。另一方面，该技术往往需要四条甚至六条引物参与反应，引物多比较容易造成假阳性扩增现象。RCA(滚环扩增技术)技术往往也需要高温变性才可以使双链打开使引物结合上去，其滚环复制扩增的特点也使其应用受诸多限制。HDA(依赖解旋酶的等温扩增技术)技术是使用解旋酶使DNA双链打开随后引物结合上去并由聚合酶进行扩增的技术。本
专利技术惊奇地发现在该等温扩增技术中解旋酶和聚合酶的相互配合对扩增起到非常关键的作用。并且经过深入分析其原理后成功筛选并且开发了一种新的突变马达蛋白。在该突变马达蛋白参与下该技术扩增性能远远超过现有的等温扩增技术。

技术实现思路

[0005]解旋酶是马达蛋白中的一大类酶。共分为六个家族，三个超级家族SF1、SF2、SF3，两个小家族Rho和DnaB类似家族，和一个分支家族AAA+家族。本专利技术中描述的解旋酶结构上属于SF1家族。该家族的酶在结构上普遍分为四个结构域，分别是1A，1B,2A,2B。四个结构域行使不同的功能。经过结构功能分析科学家们普遍认为1B和2B与双链DNA的结合关系比较密切，1A和2A与ATP水解和DNA解旋密切相关。各个结构域相互配合最终行使对双链DNA的结合和解旋的功能。
[0006]该类解旋酶在分子生物学中应用广泛。以HDA(依赖解旋酶的等温扩增技术)技术为例，其主要通过两种酶来实现DNA的等温扩增。首先就用到解旋酶，其结合到双链DNA上，并通过水解ATP供能来将双链DNA之间的氢键打开。这样使得特异性的引物能够结合到单链DNA模板上，然后由DNA聚合酶对引物进行延伸，从而完成扩增。在这个体系中，解旋酶和DNA聚合酶两者的作用需要有近乎完美的协调能力。首先解旋酶对双链DNA进行解旋的速度和能力难以人为把控。以解旋酶Tte UvrD为例，其解旋的效率往往远远大于DNA聚合酶的聚合效率。当体系中模板DNA分子数很少时，解旋酶要想高效的作用于很少的底物双链DNA分子，就需要解旋酶的浓度也比较高。解旋酶相对于DNA聚合酶处于比较强的工作优势，这样就会容易出现DNA的解旋效率进一步大于DNA聚合酶的聚合效率，引物结合到DNA上去以后还未等DNA聚合酶聚合，引物就可能被解旋酶从模板DNA上解下来，这样就会造成引物结合不上去导致扩增灵敏度低的问题。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了突变的马达蛋白，来自SF1家族，分为1A、1B、2A、2B四个结构域；采用以下方式中的至少一种突变方式获得：
[0008](1)通过1B和/或2B结构域的碱基突变使得马达蛋白提高对DNA双链的亲和力；
[0009](2)通过1A和/或2A结构域的碱基突变使得马达蛋白降低对DNA的解链速度。
[0010]所述的突变的马达蛋白中野生型马达蛋白包括解旋酶Tte UvrD、Tth UvrD、PcrA、Rep中的至少一种。Tte UvrD的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0011]所述的突变的马达蛋白，具体如下：
[0012]1A和/或2A突变包括：R71S突变、R597K突变、T34I突变、Y613I突变中的至少一种。
[0013]所述的突变的马达蛋白，具体如下：
[0014]1B和/或2B突变包括：I418G突变、P414K突变、R415I突变、I418L突变、A421K突变中的至少一种。
[0015]所述的突变的马达蛋白，包括1A和/或2A突变、1B和/或2B突变中的至少两种的任意组合；
[0016]1A和/或2A突变包括：R71S突变、R597K突变、T34I突变、Y613I突变；
[0017]1B和/或2B突变包括：I418G突变、P414K突变、R415I突变、I418L突变、A421K突变。
[0018]本专利技术发现相较于野生型酶30拷贝模板扩增不出的情况，1B/2B结构域中I418G突变酶由于对体系中很少量的DNA模板(如低至30拷贝)有更高的亲和抓取的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.突变的马达蛋白，其特征在于：来自SF1家族，分为1A、1B、2A、2B四个结构域；采用以下方式中的至少一种突变方式获得：(1)通过1B和/或2B结构域的碱基突变使得马达蛋白提高对DNA双链的亲和力；(2)通过1A和/或2A结构域的碱基突变使得马达蛋白降低对DNA的解链速度。2.根据权利要求1所述的突变的马达蛋白，其特征在于：野生型马达蛋白包括解旋酶Tte UvrD、Tth UvrD、PcrA、Rep中的至少一种，Tte UvrD的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。3.根据权利要求1所述的突变的马达蛋白，其特征在于：1A和/或2A突变包括：R71S突变、R597K突变、T34I突变、Y613I突变中的至少一种。4.根据权利要求1所述的突变的马达蛋白，其特征在于：1B和/或2B突变包括：I418G突变、P414K突变、R415I突变、I418L突变、A421K突变中的至少一种。5.根据权利要求1所述的突变的马达蛋白，其特征在于：包括1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王永利，曹曼曼，秦闯华，鞠巍，徐根明，
申请(专利权)人：湖南大地同年生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：