一种脱卤酶和制备方法及在制备阿托伐他汀中间体中的应用技术

本发明专利技术涉及生物制药技术领域，尤其是一种脱卤酶和制备方法及在制备阿托伐他汀中间体中的应用，该脱卤酶的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。在制备阿托伐他汀中间体时，以化合物II为底物，在所述脱卤酶和缓冲液的存在下，进行生物催化反应生成阿托伐他汀中间体，即化合物I；合成路线为：该制备方法简单方便，经济实用，实现了阿托伐他汀手性中间体的高效合成。他汀手性中间体的高效合成。他汀手性中间体的高效合成。

【技术实现步骤摘要】
一种脱卤酶和制备方法及在制备阿托伐他汀中间体中的应用


[0001]本专利技术涉及生物制药
，具体领域为一种制备阿托伐他汀中间体的方法。

技术介绍

[0002]阿托伐他汀钙为羟甲基戊二酰辅酶A(HMG
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CoA)还原酶抑制剂(结构式如下)。
[0003][0004]阿托伐他汀钙主要通过抑制HMGCoA还原酶的合成，从而抑制体内胆固醇的合成，降低血清低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯的含量。由于阿托伐他汀钙抑制了细胞合成胆固醇，干扰了脂蛋白的生成，使血清总胆固醇水平下降，能有效降低血清甘油三酯水平，还能升高血清高密度脂蛋白胆固醇水平。能降低某些纯合子家族性高胆固醇血症患者的血浆低密度脂蛋白胆固醇水平，而这一类型的人群，对其他降脂药治疗很少有应答。临床用于原发性高胆固醇血症、混合型高脂血症、高甘油三酯血症、纯合子家族性高胆固醇血症及防治动脉粥样硬化。他汀类药物是20世纪80年代后期开发的羟甲基戊二酰辅酶A(HMG
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CoA)还原酶抑制剂类降血脂药。
[0005]1978年，默沙东在土曲霉中分离得到具有降血脂作用的HMG
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CoA还原酶抑制剂洛伐他汀。Parke
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Davis公司(Warner
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Lambert的分公司，后被Pfizer公司收购)在默沙东的前期研究成果的基础上，设计合成了2
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苯基吡咯衍生物，于1997年开发了第五个上市的他汀类药物——阿托伐他汀。
[0006]该制剂于1996年在美国获批，并于1999年进入中国市场，商品名为立普妥，规格为10mg、20mg和40mg。
[0007]原料药全球年销售量超过600吨，预计2020年全年需求量超过700吨。阿托伐他汀原料药有着巨大的需求，其重要中间体化合物I的制备主要通过大肠杆菌进行制备：US2006009970提供了一种脱卤上氰基的酶突变体的制备方法，并通过大肠杆菌进行表达，获得了高效催化效果的脱卤酶，可用于制备化合物但是在该化合物I制备的反应中，酶最适温度相对较高，同时该反应中需要使用NaCN，该反应对人员操作要求较高。
[0008]因此，开发一种稳定性更强的脱卤酶，寻找一种绿色环保、经济化的制备方法成为了本领域亟需解决的技术难题之一。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供一种脱卤酶和制备方法及在制备阿托伐他汀中间体中的应用，利用生物催化进行脱卤、上
‑
CN基团。
[0010]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0011]一种脱卤酶，其核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
[0012]其中，所述脱卤酶的表达细胞为枯草芽孢杆菌。
[0013]进一步的，所述脱卤酶的表达细胞优选为Bacillus subtilis WB800N。
[0014]其中，所述脱卤酶的外源表达载体为pHT01。
[0015]其中，所述外源表达载体pHT01的外源序列如SEQ ID No：1所示，包括脱卤酶序列和优化后的Shine
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Dalgarno序列。
[0016]其中，所述脱卤酶序列如SEQ ID No：2所示；所述优化后的Shine
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Dalgarno序列如SEQ ID No：3所示。
[0017]本专利技术所述脱卤酶的制备方法：将核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的基因经过DNA序列合成后，进行PCR扩增，然后导入脱卤酶表达载体pHT01的BamHI和ZraI酶切位点获得重组表达载体，编号Re_vector001；
[0018]将重组表达载体Re_vector001电转入脱卤酶的表达细胞中，得到表达工程菌，经过抗生素抗性平板涂布筛选后，获得克隆菌株，经检验重组成功后，对获得的菌株进行活化后发酵培养，离心收集菌体，洗涤后获得Bacillus subtilis WB800N细胞，超声波破碎，纯化粗酶液冻干获得脱卤酶。
[0019]本专利技术所述脱卤酶在生物催化制备阿托伐他汀中间体中的应用，具体为：
[0020]以化合物II为底物，在脱卤酶和缓冲液的存在下，进行生物催化反应生成阿托伐他汀中间体，即化合物I；合成路线如下：
[0021][0022]其中，所述化合物II与所述脱卤酶的质量比为1:0.01～1。
[0023]其中，所述缓冲液为PBS缓冲液，其浓度为0.2mM，pH为6.0～8.5。
[0024]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0025]本专利技术的脱卤酶稳定性强，催化效率高，达到了经济化生产标准，且常温反应即可，操作简单便捷，对环境友好。本专利技术中添加了优化的Shine
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Dalgarno序列，外源基因的表达量大幅度增加。
[0026]与大肠杆菌表达细胞相比，本专利技术的产物中无细菌内毒素残留，且相对于大肠杆菌，枯草芽孢表达过程中极少产生对人体有害物质，因此本专利技术使用枯草芽孢杆菌生产作为医药中间体制备所需的生物催化剂，是一种安全、绿色环保且经济化的制备方法。
附图说明
[0027]图1为重组Re_vector001质粒的构建示意图。
[0028]图2为重组Re_vector002质粒的构建示意图。
[0029]图3为GC检测结果。
具体实施方式
[0030]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0031]实施例1
[0032]一、Bacillus subtilis WB800N细胞构建
[0033]将核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的基因，经过DNA序列合成后，进行PCR扩增，引物如下(序列如SEQ ID No:4
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5所示)：
[0034]F：CGCGGATCCTAAGGAGGAAAAAAAAATG；
[0035]R：GACGTCAGGCAAATAGCCCCCCGT。
[0036]PCR扩增条件：98℃3min，95℃30s，57℃90s、72℃90s，35个循环；
[0037]PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTAR Mix 25μL；
[0038]扩增后，导入脱卤酶表达载体pHT01的BamHI和ZraI酶切位点，获得重组表达载体编号Re_vector001。
[0039]之后，将重组表达载体(如图1所示)转入脱卤酶表达细胞(Bacillus subtilis WB800N)中，得到表达工程菌，挑取阳性转化子并测序鉴定其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示后，获得Bacillus subtilis WB800本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脱卤酶，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。2.根据权利要求1所述的脱卤酶，其特征在于：所述脱卤酶的表达细胞为枯草芽孢杆菌。3.根据权利要求2所述的脱卤酶，其特征在于：所述脱卤酶的表达细胞为Bacillus subtilis WB800N。4.根据权利要求1所述的脱卤酶，其特征在于：所述脱卤酶的外源表达载体为pHT01。5.根据权利要求4所述的脱卤酶，其特征在于：所述外源表达载体pHT01的外源序列如SEQ ID No：1所示，包括脱卤酶序列和优化后的Shine
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Dalgarno序列。6.根据权利要求5所述的脱卤酶，其特征在于：所述脱卤酶序列如SEQ ID No：2所示；所述优化后的Shine
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Dalgarno序列如SEQ ID No：3所示。7.权利要求1
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6任一所述脱卤酶的制备方法，其特征在于：将核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的基因经过DNA序列合成后，进行PCR扩增，然后导入脱...

【专利技术属性】
技术研发人员：石利平，李大伟，何伟，陈本顺，徐春涛，钱若灿，尹强，童林，尹斌，魏巍，邱磊，
申请(专利权)人：江苏阿尔法药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：