一种催化效率提高的环氧化物水解酶突变体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种催化效率提高的环氧化物水解酶突变体及其制备方法，环氧化物水解酶突变体是将如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第104位、第179位和第232位的氨基酸序列进行单点突变获得。制备方法：将编码环氧化物水解酶的基因克隆到质粒pET

【技术实现步骤摘要】
一种催化效率提高的环氧化物水解酶突变体及其制备方法


[0001]本专利技术涉及酶工程
，特别涉及一种催化效率提高的环氧化物水解酶突变体及其制备方法。

技术介绍

[0002]环氧化物水解酶(Epoxide hydrolase,EH,EC,3.3.2.
‑
)又称环氧化物水合酶或环氧水化酶，是一类催化水分子立体选择性的加成环氧化物水解为相应12
‑
二醇的水解酶，来源广泛，先是由Brooks等人于40多年前发现，而后在细菌、酵母、霉菌、植物、昆虫以及哺乳动物等所有类型的有机体中均发现了其存在，研究表明该酶参与催化不需要辅酶并可以立体选择性的将环氧化物水解拆分为手性环氧化物及相应的邻二醇。通过分析来源于微生物的环氧化物水解酶的序列信息，发现其大多属于α/β折叠水解酶家族，且该类型酶高的对映体选择性使得它们对于制备各类手性药物和精细化学品具有重要意义。
[0003]目前，生产环氧化物水解酶的方法主要有两种，其中，化学法存在成本较高，副产物多，环境压力大等缺点。基因克隆表达技术虽然提高了微生物EH不对称拆分环氧化物的活力,但在提高对映体选择性方面的作用不显著，在研发生产中这将造成反应速度慢、敏感度低的问题，从而导致生产周期的延长，金钱、人力的消耗。
[0004]总之，现有专利技术提供的环氧化物水解酶组作用效果一般，敏感度较低，在65℃下的半衰期较野生型缩短，伴随着热稳定性的提高，催化效率却大大降低，在工业生产中酶催化效率降低将无法正常产出合格产品，对于生产的研发来说将会大大延长生产周期，在无形中对人力、金钱都造成了相当大的损耗。此外，相对于盲目筛菌或人工(自然)诱变等手段，现有改良技术虽然缩短了酶学性质改造时间，但在酸性pH环境和中低温环境范围内稳定有所下降。当环境发生变化时，生产产品质量得不到保障，会造成产率低、合格率低等问题。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种不仅催化效率高，而且热稳定性好、酶活强的环氧化物水解酶突变体。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案为：
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种环氧化物水解酶突变体，所述环氧化物水解酶突变体是将如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第104位、第179位和第232位的氨基酸序列进行单点突变获得。
[0008]进一步地，所述环氧化物水解酶突变体为下列之一：
[0009]将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列第104位的苏氨酸突变为赖氨酸；
[0010]将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列第179位的异亮氨酸突变为亮氨酸；
[0011]将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列第232位的天冬氨酸突变为丝氨酸；
[0012]本专利技术还提供一种编码所述环氧化物水解酶突变体的基因，所述突变体基因的碱基序列是以SEQ ID NO.1为基础进行突变的。
[0013]本专利技术还提供一种携带所述环氧化物水解酶突变体基因的重组载体。
[0014]第二方面，本专利技术还提供一种环氧化物水解酶突变体的制备方法，包括如下步骤：
[0015]S1、将SEQ ID NO.1所示序列与pET
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28a(+)质粒连接，构成重组表达载体pET
‑
28a(+)
‑
EHJ；
[0016]S2、以重组载体pET
‑
28a(+)
‑
EHJ为模板，利用特异性定点突变引物构建环氧化物水解酶突变体重组表达载体；
[0017]S3、将重组载体pET
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28a(+)
‑
EHJ及突变体载体热击转化感受态，涂布抗性LB固体培养基中，过夜培养后进行菌落PCR验证；
[0018]S4、将经过验证的阳性克隆子提取质粒，转化E.coli BL21(DE3)后再次筛选出阳性克隆子，接种至含硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，再按2％(v/v)的接种量接入装有100ml LB培养基的500ml三角瓶中，置于37℃、200rpm摇床振荡培养，当培养液OD600达到合适值时，加入IPTG作为诱导剂进行诱导表达。
[0019]进一步地，步骤S2所述特异性定点突变引物为：
[0020]Thr104
‑
F：GTAGAGCTTCTCAAGGATGGTTGGGAAC；
[0021]Thr104
‑
R：GTTCCCAACCATCCTTGAGAAGCTCTAC；
[0022]Lle179
‑
F：GTGCAGCGACTTTATCGGGCATTGCTCCGT；
[0023]Lle179
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R：ACGGAGCAATGCCCGATAAAGTCGCTGCAC；
[0024]Asp232
‑
F：CGACTTTCTGGTTTCAAGTATAAGCGAA；
[0025]Asp232
‑
R：TTCGCTTATACTTGAAACCAGAAAGTCG。
[0026]进一步地，步骤S3所述感受态细胞为大肠杆菌DH5α感受态细胞，所述抗性LB固体培养基为含卡那霉素抗性的LB固体培养基。
[0027]进一步地，步骤S4所述含硫酸卡那霉素的LB培养基中硫酸卡那霉素的浓度为50mg/L。
[0028]进一步地，步骤S4所述培养液OD600的合适值为0.6
‑
0.8。
[0029]进一步地，所述IPTG诱导剂的浓度为0.5mM，诱导条件为28℃培养10h。将所述环氧化物水解酶突变体基因连接pET
‑
28a(+)载体，并转化E.coli BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。
[0030]与现有技术相比，本专利技术的有益效果：
[0031]对环氧化物水解酶原有基因片段进行单点突变，得到环氧化物水解酶突变体，与野生型环氧化物水解酶相比，突变体的热稳定性与酶活均大大增强，可以提高工业化生产中环氧化物水解酶的适用寿命。
附图说明
[0032]利用附图对本专利技术作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本专利技术的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。
[0033]图1为本专利技术一种环氧化物水解酶突变体的重组载体pET
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28a(+)
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EHJ的重组质粒图；
[0034]图2为本专利技术一种环氧化物水解酶突变体的SDS
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PAGE图；
[0035]图3为本专利技术一种环氧化物水解酶突变体的稳定性与酶活性的变化图。
具体实施方式
[0036]下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本专利技术，但并不构成对本专利技术的限定。此外，下面所描述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种环氧化物水解酶突变体，其特征在于：所述环氧化物水解酶突变体为下列之一：将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列第104位的苏氨酸突变为赖氨酸；将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列第179位的异亮氨酸突变为亮氨酸；将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列第232位的天冬氨酸突变为丝氨酸。2.一种编码权利要求1所述环氧化物水解酶突变体的基因。3.一种含有权利要求2所述基因的重组载体。4.一种根据权利要求1所述环氧化物水解酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将SEQ ID NO.1所示序列与pET
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28a(+)质粒连接，构成重组表达载体pET
‑
28a(+)
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EHJ；S2、以重组载体pET
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28a(+)
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EHJ为模板，利用特异性定点突变引物构建环氧化物水解酶突变体重组表达载体；S3、将重组载体pET
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28a(+)
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EHJ及突变体载体热击转化感受态，涂布抗性LB固体培养基中，过夜培养后进行菌落PCR验证；S4、将经过验证的阳性克隆子提取质粒，转化E.coli BL21(DE3)后再次筛选出阳性克隆子，接种至含硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，再按体积分数为2％的接种量接入装有100ml LB培养基的500ml三角瓶中，置于37℃和200rpm的条件下摇床振荡培养，当培养液OD600达到合适值时，加入IPTG作为诱导剂进行诱导表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宇，刘佳琦，张畅，
申请(专利权)人：深圳市微滴科技顾问有限公司，
类型：发明
国别省市：