【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶催化反应，具体领域为一种采用管式反应器制备依鲁替尼手性中间体的方法。
技术介绍
1、依鲁替尼，cas号为936563-96-1，可用于套细胞淋巴瘤(mcl)的治疗。s-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶，cas号为143900-44-1，是制备依鲁替尼的重要中间体，可以由1-叔丁氧羰基-3-哌啶酮制得，同时引入手性中心。s-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的传统合成方法有化学还原和生物还原两种方法。
2、wo2011036280a1公开了利用化学催化方法制备s-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶，但是由于效率较低，反应条件苛刻，产生的三废较多，无法实现工业化应用。
3、cn109182410b、cn106520855a公开了采用生物还原法实现在这一过程，利用酮还原酶将1-叔丁氧羰基-3-哌啶酮立体选择性还原为s-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶，这种方法的立体选择性较好，但是酶的用量大，并且反应时间较长，在一定程度上会导致成本升高。
4、目前，用于实现该工艺路线的实验设备多为传统的反应釜或反应瓶，操作过程繁琐，反应时间长，工艺成本较高。因此，开发一种依鲁替尼手性中间体的制备方法成为了本领域亟需解决的技术问题之一。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种采用管式反应器制备依鲁替尼手性中间体的方法，该方法反应时间只需数十秒，其反应效率高、自动化程度高、手性目标产物光学纯度高，酶的用量小，后处理简单，成本较低。
2、为实现上述目的，本专
3、一种采用管式反应器制备依鲁替尼手性中间体的方法，其合成路线如下：
4、
5、其中，所述酮还原酶为nb-3401酮还原酶，如seq id no：1所示；所述葡萄糖脱氢酶为gj6702，如seq id no：2所示。
6、具体包括如下步骤：
7、一、制备酶溶液
8、1)转化：将含有nb-3401或gj6702目的基因的质粒转入大肠杆菌感受态，涂板过夜培养；
9、2)保种：挑取单克隆培养6-8h，灭菌后的甘油添加30％，-80℃下保存菌种；
10、3)摇瓶培养：取保存好的菌种，接种至摇瓶培养基，培养至合格；
11、4)种子罐培养：摇瓶种子液接种至一级种子罐，培养至合格；
12、5)发酵罐培养：培养好的种子液转移至发酵罐进行培养，诱导目的蛋白合成，培养至合格；
13、6)提取包装：菌液经浓缩、破碎后包装。
14、二、制备目标产物
15、(1)制备物料a：将三水合磷酸氢二钾和磷酸二氢钾加至水中溶解，再加入1-叔丁氧羰基-3-哌啶酮，搅拌均匀，得到物料a，置于原料罐a(该原料罐底部通过阀门与管式反应器相应的进料管道相连)中备用；
16、(2)制备物料b：将葡萄糖、葡萄糖脱氢酶、辅酶、酮还原酶、20％碳酸钠溶液混合均匀，得到物料b，将其置于原料罐b(该原料罐底部通过阀门与管式反应器相应的进料管道相连)中备用；
17、(3)将所述物料a和所述物料b分别泵入至管式反应器中进行反应，待反应结束后，接收反应产物；
18、(4)向反应产物中加入乙酸乙酯、硅藻土，搅拌均匀后分液，打浆过滤，合并有机相，萃取，洗涤，50℃减压蒸干；加入正己烷升温至溶清，再缓慢降温析晶，离心，干燥，即可得到目标产物。
19、优选地，辅酶选自nad、nadh、nadp和nadph的任意一种或组合，进一步优选为nadp。
20、优选地，第二步的步骤(3)中的反应温度为25-35℃，包括但不限于25℃、30℃、35℃，优选为30℃。
21、优选地，第二步的步骤(3)中的反应时间为40-80s，包括但不限于40s、45s、50s、55s、60s、65s、70s、75s、80s，优选为50s。
22、优选地，第二步的步骤(4)中的析晶温度为-5-5℃，包括但不限于-5℃、-3℃、0℃、3℃、5℃，优选为3℃。
23、优选地，1-叔丁氧羰基-3-哌啶酮与nb-3401酶溶液的投入质量比为1:0.55-0.75，包括但不限于1:0.55、1:0.60、1:0.65、1:0.70、1:0.75，优选为1:0.65。
24、优选地，1-叔丁氧羰基-3-哌啶酮与20％碳酸钠溶液的投料质量比为1:0.8-1.3，包括但不限于1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3，进一步优选为1:1.0。
25、优选地，1-叔丁氧羰基-3-哌啶酮与葡萄糖的投料质量比为1:0.8-1.7，包括但不限于1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7，进一步优选为1:1.2。
26、优选地，1-叔丁氧羰基-3-哌啶酮与gj6702葡萄糖脱氢酶的投料质量比为1:0.13-0.43，包括但不限于1:0.13、1:0.17、1:0.20、1:0.23、1:0.26、1:0.30、1:0.33、1:0.37、1:0.40、1:0.43，进一步优选为1:0.33。
27、优选地，1-叔丁氧羰基-3-哌啶酮与辅酶的投料质量比为1:0.03-0.08，包括但不限于1:0.03、1:0.04、1:0.05、1:0.06、1:0.07、1:0.08，进一步优选为1:0.05。
28、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
29、本专利技术首次在连续流管式反应器中用生物方法合成目标产物依鲁替尼手性中间体，以1-叔丁氧羰基-3-哌啶酮为原料，在酮还原酶、葡萄糖脱氢酶、辅酶的作用下，发生不对称还原反应，合成目标产物。该方法反应时间只需数十秒，反应效率高、自动化程度高，反应条件温和，目标产物收率高达98％以上，手性目标产物光学纯度高达99.9％以上，单杂少。本专利技术首次将nb-3401酮还原酶应用于1-叔丁氧羰基-3-哌啶酮不对称还原制备s-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶中，取得很好的效果，酶的用量小，后处理简单，成本较低。
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1.一种采用管式反应器制备依鲁替尼手性中间体的方法，其特征在于：其合成路线如下：
2.根据权利要求1所述的采用管式反应器制备依鲁替尼手性中间体的方法，其特征在于：所述酮还原酶为NB-3401酮还原酶，如SEQ ID NO：1所示；所述葡萄糖脱氢酶为GJ6702，如SEQ ID NO：2所示。
3.根据权利要求2所述的采用管式反应器制备依鲁替尼手性中间体的方法，其特征在于：所述NB-3401酮还原酶或GJ6702葡萄糖脱氢酶的制备方法如下：
4.根据权利要求1所述的采用管式反应器制备依鲁替尼手性中间体的方法，其特征在于：步骤(3)中的反应温度为25-35℃。
5.根据权利要求1所述的采用管式反应器制备依鲁替尼手性中间体的方法，其特征在于：步骤(3)中的反应时间为40-80s。
6.根据权利要求1所述的采用管式反应器制备依鲁替尼手性中间体的方法，其特征在于：步骤(4)中的析晶温度为-5-5℃。
7.根据权利要求1所述的采用管式反应器制备依鲁替尼手性中间体的方法，其特征在于：1-叔丁氧羰基-3-哌啶酮与NB-340
8.根据权利要求1所述的采用管式反应器制备依鲁替尼手性中间体的方法，其特征在于：所述辅酶选自NAD、NADH、NADP和NADPH的至少一种。
9.根据权利要求8所述的采用管式反应器制备依鲁替尼手性中间体的方法，其特征在于：所述辅酶为NADP。
10.根据权利要求9所述的采用管式反应器制备依鲁替尼手性中间体的方法，其特征在于：所述1-叔丁氧羰基-3-哌啶酮与20％碳酸钠溶液的投入质量比为1:1.0。
...【技术特征摘要】
1.一种采用管式反应器制备依鲁替尼手性中间体的方法，其特征在于：其合成路线如下：
2.根据权利要求1所述的采用管式反应器制备依鲁替尼手性中间体的方法，其特征在于：所述酮还原酶为nb-3401酮还原酶，如seq id no：1所示；所述葡萄糖脱氢酶为gj6702，如seq id no：2所示。
3.根据权利要求2所述的采用管式反应器制备依鲁替尼手性中间体的方法，其特征在于：所述nb-3401酮还原酶或gj6702葡萄糖脱氢酶的制备方法如下：
4.根据权利要求1所述的采用管式反应器制备依鲁替尼手性中间体的方法，其特征在于：步骤(3)中的反应温度为25-35℃。
5.根据权利要求1所述的采用管式反应器制备依鲁替尼手性中间体的方法，其特征在于：步骤(3)中的反应时间为40-80s。
<...【专利技术属性】
技术研发人员：石利平，徐秋斌，黄新明，刘建峰，周慧，于娜娜，尹强，
申请(专利权)人：江苏阿尔法药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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